Иммуномодулятор метаболиттар шеш микромөхитенең (ШММ) төп үҙенсәлеге булып тора, әммә бер нисә осраҡтан тыш, уларҙы үҙенсәлектәре күпселек осраҡта билдәһеҙ булып ҡала. Бында беҙ был төрлө ТМЭ отсектарының метаболомын асыу өсөн юғары дәрәжәле сероз карцинома (HGSC) менән ауырығандар шештәренән һәм асцитынан шештәрҙе һәм Т-күҙәнәктәрҙе анализланыҡ. Асцит һәм шеш күҙәнәктәрендә метаболиттар араһында ҙур айырма бар. Асцит менән сағыштырғанда, шешкә инфильтрациялаусы Т-күҙәнәктәр 1-метилникотинамид (МНК) менән һиҙелерлек байытылған. Т-күҙәнәктәрҙә МНК кимәле күтәрелһә лә, никотинамид N-метилтрансферазаның (S-аденозилметиониндан никотинамидҡа метил төркөмдәренең күсеүен катализлаусы фермент) экспрессияһы фибробластар һәм шеш күҙәнәктәре менән генә сикләнә. Функциональ яҡтан МНК Т-күҙәнәктәрҙе шеште үҫтергән цитокин шеш некрозы факторы альфа бүлеп сығарыуға индуцирлай. Шуға күрә ТМЭ-нан алынған МНК Т-күҙәнәктәрҙең иммун көйләүенә булышлыҡ итә һәм кеше яман шешен дауалау өсөн потенциаль иммунотерапия маҡсаты булып тора.
Шештән алынған метаболиттар шешкә ҡаршы иммунитетҡа тәрән тормошҡа ашырыуҙы тыйыусы йоғонто яһай ала, һәм күберәк һәм күберәк дәлилдәр күрһәтеүенсә, улар шулай уҡ сирҙең прогрессив үҫеше өсөн төп этәргес көс булып хеҙмәт итә ала (1). Варбург эффектынан тыш, һуңғы ваҡытта шеш күҙәнәктәренең метаболизм хәлен һәм уның шеш микромөхитенең (ШММ) иммун хәле менән бәйләнешен характерлау буйынса эштәр башлана. Сысҡан моделдәре һәм кеше Т-күҙәнәктәре буйынса үткәрелгән тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, глутамин алмашыныуы (2), окисланыу алмашыныуы (3) һәм глюкоза алмашыныуы (4) төрлө иммун күҙәнәктәре подгруппаларында үҙ аллы эш итә ала. Был юлдарҙағы бер нисә метаболит Т-күҙәнәктәрҙең шешкә ҡаршы функцияһын тотҡарлай. Тетрагидробиоптерин (ВН4) коферментының блокадаһы Т-күҙәнәктәрҙең пролиферацияһына зыян килтерә ала, ә организмда ВН4-тың артыуы CD4 һәм CD8 аша шешкә ҡаршы иммун яуапты көсәйтә ала икәнлеге иҫбатланған. Бынан тыш, иммуносупрессив эффекты кинуренин ҡотҡарырға мөмкин идара итеү BH4 (5). Изоцитрат дегидрогеназа (IDH) мутант глиобластома, энантиометаболизм (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) секрецияһы Т-күҙәнәктәрҙең активлашыуын, пролиферацияһын һәм цитолизын тормошҡа ашыра Эшмәкәрлек (6). Һуңғы ваҡытта гликолиздың өҫтәмә продукты булған метилглиоксалдың миелоид сығышлы супрессор күҙәнәктәр тарафынан етештерелеүе, ә метилглиоксалдың Т-күҙәнәктәргә күсеүе эффектор Т-күҙәнәк функцияһын тотҡарлай алыуы күрһәтелгән. Дауалауҙа метилглиоксалды нейтралләштереү миелоидтан алынған супрессор күҙәнәктәренең (МДСК) эшмәкәрлеген еңә ала һәм сысҡан моделдәрендә тикшерелгән пункт блокада терапияһын синергик рәүештә көсәйтә (7). Был тикшеренеүҙең берлектә Т-күҙәнәктәрҙең функцияһын һәм эшмәкәрлеген көйләүҙә ТМЭ-нан алынған метаболиттар төп ролен һыҙыҡ өҫтөнә ала.
Т-күҙәнәк дисфункцияһы киң хәбәр ителә яман шеш йомортҡалыҡ (8). Был өлөшләтә гипоксияға һәм шеш ҡан тамырҙары аномалияһына хас метаболизм үҙенсәлектәре менән бәйле (9), һөҙөмтәлә глюкоза һәм триптофан һөт кислотаһы һәм кинуренин кеүек өҫтәмә продукттарға әйләнә. Артыҡ күҙәнәктән тыш лактат интерферон-γ (ИФН-γ) етештереүҙе кәметә һәм миелосупрессив подгруппалар дифференциацияһын этәрә (10, 11). Триптофан ҡулланыу туранан-тура Т-күҙәнәк пролиферацияһын тотҡарлай һәм Т-күҙәнәк рецепторҙары сигнал биреүҙе тотҡарлай (12-14). Был күҙәтеүҙәргә ҡарамаҫтан, иммун алмашыныуы тирәләй күп эштәр in vitro Т-күҙәнәк культураһында оптималь матдәләр ҡулланып башҡарылған, йәки in vivo гомолог сысҡан моделдәре менән сикләнгән, улар араһында берәү ҙә кеше яман шештәренең гетерогенлығын һәм Физиологик макро һәм микро мөхитте тулыһынса сағылдыра.
Йомортҡалыҡ яман шешенең дөйөм үҙенсәлеге булып перитонеаль таралыу һәм асцит барлыҡҡа килә. Асцитта күҙәнәк шыйыҡсаһының тупланыуы сирҙең алға киткән үҫеше һәм насар прогноз менән бәйле (15). Хәбәрҙәр буйынса, был үҙенсәлекле отделение гипоксиялы, ҡан тамырҙары эндотелийының үҫеш факторы (VEGF) һәм индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) юғары кимәлдә, Т-регулятор күҙәнәктәр һәм миелоид ингибитор күҙәнәктәр инфильтрациялана (15-18). Асциттың матдәләр алмашыныуы мөхите шештең үҙенән айырылыуы ихтимал, шуға күрә перитонеаль киңлектә Т-күҙәнәктәрҙең ҡайтанан программаланыуы аныҡ түгел. Бынан тыш, шеш мөхитендә булған асцит һәм метаболиттар араһындағы төп айырмалар һәм гетерогенлыҡ иммун күҙәнәктәренең инфильтрацияһына һәм уларҙы шештәрҙә башҡарыуға ҡамасаулай ала, шуға күрә артабанғы тикшеренеүҙәр кәрәк.
Был мәсьәләләрҙе хәл итеү маҡсатында, беҙ һиҙгер күҙәнәк айырыу һәм шыйыҡса хроматография тандем масс-спектрометрия (LC-MS/MS) ысулын өйрәнеү өсөн төрлө күҙәнәк типтары (шул иҫәптән CD4 + һәм CD8 + Т күҙәнәктәре), шулай уҡ эсендә һәм шештәр араһында Уның метаболиттары күҙәнәктәрҙе span бер үк асцит һәм шеш пациент мөхитендә. Был ысулды беҙ юғары үлсәмле ағым цитометрияһы һәм бер күҙәнәкле РНК-ны секвенированиелау (scRNA-seq) менән берлектә ҡулланабыҙ, был төп популяцияларҙағы метаболизм статусының юғары хәл ителгән портретын тәьмин итеү өсөн. Был ысул шеш Т-күҙәнәктәрендә 1-метилникотинамид (МНК) кимәленең һиҙелерлек артыуын асыҡлай, ә in vitro тәжрибәләре МНК-ның Т-күҙәнәктәр функцияһына иммуномодулятор тәьҫире быға тиклем билдәһеҙ булыуын күрһәтә. Ғөмүмән, был ысул шештәр һәм иммун күҙәнәктәре араһындағы үҙ-ара метаболизм үҙ-ара тәьҫир итешеүен аса, иммун көйләү метаболиттары тураһында үҙенсәлекле төшөнсәләр бирә, улар Т-күҙәнәктәр нигеҙендә йомортҡалыҡ яман шешен дауалау өсөн файҙалы булыуы мөмкин иммунотерапия Дауалау мөмкинлектәре.
Беҙ юғары үлсәмле ағым цитометрия ҡулланылған, бер үк ваҡытта һанлы глюкоза ҡабул итеү [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) һәм митохондрия эшмәкәрлеге [MitoTracker тәрән ҡыҙыл (MT7de) тарафынан] иммун күҙәнәктәрен һәм шеш күҙәнәктәре популяцияларын айырған типик маркерҙар (S2 таблицаһы һәм S1A һүрәте). Был анализ күрһәтеүенсә, Т-күҙәнәктәр менән сағыштырғанда, асцит һәм шеш күҙәнәктәрендә глюкозаны үҙләштереү кимәле юғарыраҡ, әммә митохондрия эшмәкәрлегендә айырмалар бәләкәйерәк. Уртаса глюкоза ҡабул итеү шеш күҙәнәктәре [CD45-EpCAM (EpCAM)+] өс-дүрт тапҡырға Т-күҙәнәктәр, һәм уртаса глюкоза ҡабул итеү CD4 + Т-күҙәнәктәре 1.2 тапҡыр CD8 + Т-күҙәнәктәре, был күрһәтә Шеш инфильтрация лимфоциттарында метаболизм (ТИЛ евен төрлө ТМЕ талап итә). Ә шеш күҙәнәктәрендә митохондрия эшмәкәрлеге CD4 + Т күҙәнәктәренә оҡшаш, ә ике күҙәнәк тибының да митохондрия эшмәкәрлеге CD8 + Т күҙәнәктәренә ҡарағанда юғарыраҡ (1-се һүрәт, В). Ғөмүмән, был һөҙөмтәләр матдәләр алмашыныуы кимәлен асыҡлай. Шеш күҙәнәктәренең метаболизм активлығы CD4 + Т күҙәнәктәренә ҡарағанда юғарыраҡ, ә CD4 + Т күҙәнәктәренең метаболизм активлығы CD8 + Т күҙәнәктәренә ҡарағанда юғарыраҡ. Күҙәнәк типтары буйынса был эффекттарға ҡарамаҫтан, CD4 + һәм CD8 + Т күҙәнәктәренең метаболизм статусында йәки уларҙы асцитта шештәр менән сағыштырғанда сағыштырмаса өлөшөндә эҙмә-эҙлекле айырма юҡ (1С һүрәте). Ә CD45 күҙәнәк фракцияһында шештә EpCAM+ күҙәнәктәренең өлөшө асцит менән сағыштырғанда арта (1D һүрәте). Беҙ шулай уҡ асыҡ метаболизм айырмаһы күҙәтелгән EpCAM + һәм EpCAM- күҙәнәк компоненттары. EpCAM+ (шеш) күҙәнәктәре юғары глюкоза ҡабул итеү һәм митохондрия эшмәкәрлеге EpCAM- күҙәнәктәренә ҡарағанда, был күпкә юғары метаболизм эшмәкәрлеге фибробласттар шеш күҙәнәктәрендә ТМЭ (һүрәт 1, Е һәм F).
(А һәм В) Медиана флуоресценция интенсивлығы (МФИ) глюкоза ҡабул итеү (2-NBDG) (А) һәм митохондрия эшмәкәрлеге CD4 + Т күҙәнәктәре (MitoTracker ҡара ҡыҙыл) (Б) Вәкиллекле графиктар (һул) һәм таблицалы мәғлүмәттәр (Уң), CD8 + Т күҙәнәктәре һәм EpCAM + Т күҙәнәктәре һәм EpCAM + Т күҙәнәктәренән а. (С) CD4 + һәм CD8 + күҙәнәктәренең (CD3 + Т күҙәнәктәренең) нисбәте асцит һәм шеш. (D) өлөшө EpCAM + шеш күҙәнәктәре асцит һәм шеш (CD45−). (Е һәм F) EpCAM + CD45-шеш һәм EpCAM-CD45-матрица глюкоза ҡабул итеү (2-NBDG) (Е) һәм митохондрия эшмәкәрлеге (MitoTracker ҡара ҡыҙыл) (F) вәкиллекле графиктар (һул) һәм таблицалы мәғлүмәттәр ( Уң) Асцит һәм шеш күҙәнәктәре. (G) CD25, CD137 һәм PD1 экспрессияһының ағым цитометрияһы ярҙамында күрһәтелгән графиктары. (Н һәм I) CD25, CD137 һәм PD1 экспрессияһы CD4 + Т-күҙәнәктәрҙә (Н) һәм CD8 + Т-күҙәнәктәрҙә (I). (J һәм K) Наивный, үҙәк хәтер (Tcm), эффектор (Teff) һәм эффектор хәтер (Tem) фенотиптары нигеҙендә CCR7 һәм CD45RO экспрессияһы. Асцит һәм шештәрҙә CD4 + Т-күҙәнәктәрҙең (J) һәм CD8 + Т-күҙәнәктәренең (K) репрезентатив һүрәттәре (һулдан) һәм таблица мәғлүмәттәре (уңдан). Р ҡиммәттәре парлы t-тест ярҙамында билдәләнә (*Р<0,05, **Р<0,01 һәм ***Р<0,001). Һыҙыҡ тап килгән пациенттарҙы күрһәтә (n = 6). ФМО, флуоресценция минус бер; МФИ, медиана флуоресценция интенсивлығы.
Артабан анализлау юғары хәл ителгән Т-күҙәнәк фенотипик статусы араһындағы башҡа әһәмиәтле айырмаларҙы асыҡланы. 1-се һүрәт, G-нан I-гә тиклем) һәм эффектор хәтере (1-се һүрәт, J һәм K) шештәрҙә асцитҡа ҡарағанда күпкә йышыраҡ осрай (CD3 + Т-күҙәнәктәр өлөшө). Шулай уҡ, анализлау фенотип экспрессияһы активация маркерҙары (CD25 һәм CD137) һәм маркерҙары ярлыланыу [программаланған күҙәнәк үлем аҡһым 1 (PD1)] күрһәткән, тип, был популяциялар метаболизм үҙенсәлектәре төрлө булһа ла (һүрәт S1, В тиклем Е) , Әммә бер ниндәй ҙә әһәмиәтле метаболизм айырмалары subfigure observise араһында эҙмә-эҙлекле булды, йәки (һүрәт S1). F - I). Был һөҙөмтәләр раҫланды, машина өйрәнеү ысулдарын ҡулланып, автоматик рәүештә күҙәнәк фенотиптарын тәғәйенләү (21), был артабан асыҡланды, күп һанлы һөйәк мие күҙәнәктәре (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) пациенттың асцит (һүрәт S2A ). Бөтә билдәләнгән күҙәнәк төрҙәре араһында был миелоид күҙәнәк популяцияһы иң юғары глюкоза алыу һәм митохондрия эшмәкәрлеген күрһәткән (һүрәт S2, B - G). Был һөҙөмтәләр HGSC ауырыуҙарында асцит һәм шештәрҙә осраған күп күҙәнәк типтары араһында көслө метаболизм айырмаларын билдәләй.
ТИЛ-дың метабономик үҙенсәлектәрен аңлауҙа төп мәсьәлә булып шештәрҙән етерлек таҙалыҡтағы, сифатлы һәм күләмдәге Т-күҙәнәк өлгөләрен айырып алыу кәрәклеге тора. Һуңғы тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, сорттарға бүлергә һәм монстр байытыу ысулдары нигеҙендә ағым цитометрияһы күҙәнәк метаболиттары профилдәре үҙгәрештәргә килтерергә мөмкин (22-24). Был проблеманы еңер өсөн, беҙ оптималь ысулын изоляциялау һәм изоляциялау өсөн ТИЛ хирургик резекция кеше йомортҡалыҡ яман шеше анализлау алдынан LC-MS/MS (ҡара: Материалдар һәм ысулдар; һүрәт 2А). Был протоколдың метаболиттар үҙгәрештәренә дөйөм йоғонтоһон баһалау маҡсатында беҙ өҫтәге монстр айырыу аҙымынан һуң һау донорҙар тарафынан әүҙемләштерелгән Т-күҙәнәктәрҙең метаболит профилдәрен монстр айырылмаған, әммә боҙҙа ҡалған күҙәнәктәр менән сағыштырҙыҡ. Был сифатты контролдә тотоу анализы асыҡланы, был ике шарт араһында юғары корреляция бар (r = 0,77), һәм техник ҡабатланыусанлыҡ төркөмө 86 метаболиттар юғары ҡабатланыусанлыҡҡа эйә (һүрәт 2В). Шуға күрә был ысулдар күҙәнәктәрҙә күҙәнәк тибы байытыу үткән күҙәнәктәрҙә метаболиттарҙы теүәл анализлай ала, шулай итеп, HGSC-ла махсус метаболиттарҙы асыҡлау өсөн беренсе юғары сифатлы платформа тәьмин итә, шуның менән кешеләргә күҙәнәк спецификаһын тәрән аңларға мөмкинлек бирә Енси алмашыныу программаһы.
(А) Магнит монстрҙары байытыуының схематик схемаһы. LC-MS/MS анализы алдынан күҙәнәктәр өс тапҡыр рәттән магнит монстрҙары менән байытыу үтәсәк йәки боҙҙа ҡаласаҡ. (Б) Байытыу тибы метаболиттар күплегенә йоғонтоһо. Һәр байытыу тибы өсөн уртаса өс үлсәү ± SE. Һоро һыҙыҡ 1:1 бәйләнешен күрһәтә. Ҡабатланған үлсәүҙәрҙең класс эсендәге корреляцияһы (КЭК) күсәр ярлығында күрһәтелгән. НАД, никотинамид аденин динуклеотид. (С) Схематик схема эш ағымы пациент метаболит анализ. Асцит йәки шештәр ауырыуҙарҙан йыйыла һәм криоконсервациялана. Һәр өлгөнөң бәләкәй генә өлөшө ағым цитометрияһы ярҙамында анализланған, ә ҡалған өлгөләр CD4+, CD8+ һәм CD45- күҙәнәктәре өсөн өс раунд байытыу үткән. Был күҙәнәк фракциялары LC-MS/MS ҡулланып анализланған. (D) стандартлаштырылған метаболиттар күплеге йылылыҡ картаһы. Дендрограмма өлгөләр араһындағы евклидий арауыҡтарҙы Уордтың кластерлаштырыуын күрһәтә. (Е) Төп компонент анализ (ПКА) өлгө метаболит картаһы, күрһәтеү өс реплика һәр өлгө, өлгөләр бер үк пациент һыҙыҡ менән тоташтырылған. (F) ПКА метаболит профиле өлгөһө шартлы пациент (йәғни, өлөшләтә избыточность ҡулланыу); өлгө тибы ҡабарынҡы корпус менән сикләнә. PC1, төп компонент 1; PC2, төп компонент 2.
Артабан, беҙ был байытыу ысулын ҡулланып анализлау өсөн 99 метаболиттар CD4 +, CD8 + һәм CD45-күҙәнәк фракциялары беренсел асцит һәм шештәр алты HGSC пациенттар (һүрәт 2С, һүрәт S3A һәм таблица S3 һәм S4). Ҡыҙыҡһыныу популяцияһы 2% -тан 70% -ҡа тиклем тере күҙәнәктәрҙең тәүге ҙур өлгөһөн тәшкил итә, ә күҙәнәктәр өлөшө пациенттар араһында ныҡ айырыла. Һуңынан монстрҙарҙы айырғандан һуң, ҡыҙыҡһыныу байытылған өлөшө (CD4+, CD8+ йәки CD45-) өлгөләге бөтә тере күҙәнәктәрҙең уртаса 85%-тан ашыуын тәшкил итә. Был байытыу ысулы кеше шеш туҡымаһы алмашыныуынан күҙәнәк популяцияларын анализларға мөмкинлек бирә, был ҙур өлгөләрҙән эшләү мөмкин түгел. Был протоколды ҡулланып, беҙ билдәләне, тип l-кинуренин һәм аденозин, был ике яҡшы характеристика иммуносупрессив метаболиттар шеш Т күҙәнәктәрендә йәки шеш күҙәнәктәрендә күтәрелгән (һүрәт S3, В һәм С). Шуға күрә был һөҙөмтәләр беҙҙең күҙәнәктәрҙе айырыу һәм масс-спектрометрия технологияһының тоғролоғон һәм пациент туҡымаларында биологик мөһим метаболиттарҙы табыу һәләтен күрһәтә.
Беҙҙең анализ шулай уҡ асыҡланды көслө метаболизм айырыу күҙәнәк типтары эсендә һәм пациенттар араһында (һүрәт 2D һәм һүрәт S4A). Атап әйткәндә, башҡа пациенттар менән сағыштырғанда, пациент 70 төрлө метаболизм үҙенсәлектәрен күрһәткән (һүрәт 2Е һәм һүрәт S4B), был пациенттар араһында ҙур метаболизм гетерогенлығы булыуы мөмкинлеген күрһәтә. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: башҡа пациенттар менән сағыштырғанда (1,2-нән 2 литрға тиклем; S1 таблицаһы), 70-се пациентта йыйылған асциттың дөйөм күләме (80 мл) әҙерәк булған. Төп компонент анализы ваҡытында пациенттар араһындағы гетерогенлыҡты контролдә тотоу (мәҫәлән, өлөшләтә избыточность анализы ҡулланып) күҙәнәк типтары араһында эҙмә-эҙлекле үҙгәрештәр күрһәтә, ә күҙәнәк типтары һәм/йәки микромөхит аныҡ агрегацияланған метаболит профиле буйынса (һүрәт 2F ). Яңғыҙ метаболиттарҙы анализлау был эффекттарҙы һыҙыҡ өҫтөнә алды һәм күҙәнәк төрҙәре һәм микромөхит араһында һиҙелерлек айырмаларҙы асыҡланы. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: күҙәтелгән иң экстремаль айырма – МНК, ул, ғәҙәттә, CD45- күҙәнәктәре һәм шешкә инфильтрациялаусы CD4+ һәм CD8+ күҙәнәктәре менән байытыла (3-сө һүрәт А). CD4 + күҙәнәктәр өсөн был эффект иң асыҡ күренә, CD8 + күҙәнәктәрендәге МНК-ға ла тирә-яҡ мөхит ныҡ йоғонто яһай кеүек. Әммә был мөһим түгел, сөнки алты пациенттың өсәүһен генә шеш CD8+ баллдары буйынса баһаларға мөмкин. МНК-нан тыш, асцит һәм шештәрҙәге күҙәнәктәрҙең төрлө төрҙәрендә ТИЛ-да насар характерланған башҡа метаболиттар ҙа дифференциаль бай (S3 һәм S4 һүрәттәре). Шуға күрә был мәғлүмәттәр артабанғы тикшеренеүҙең перспективалы иммуномодулятор метаболиттар йыйылмаһын аса.
(А) CD4+, CD8+ һәм CD45- күҙәнәктәрендә МНК-ның асцит һәм шештән нормалаштырылған содержаниеһы. Йәшник графикында медиана (һыҙыҡ), кварталдар араһындағы диапазон (рамка шарниры) һәм мәғлүмәт диапазоны күрһәтелгән, кварталдар араһындағы диапазондан 1,5 тапҡырға тиклем (рамка мыйығы). Пациент материалдары һәм ысулдары һүрәтләнгәнсә, пациенттың лимма ҡиммәтен ҡулланып, Р ҡиммәтен билдәләү (*Р<0,05 һәм **Р<0,01). (Б) МНК алмашыныуының схематик схемаһы (60). Метаболиттар: S-аденозил-1-метионин; САХ, S-аденозин-1-гомоцистеин; Н.А., никотинамид; МНК, 1-метилникотинамид; 2-ПЙ, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-ПЙ, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибозаһы; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ферменттар (йәшел): ННМТ, никотинамид N-метилтрансфераза; СИРТ, сиртуиндар; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансферазаһы; АОХ1, альдегид оксидаза 1; НРК, никотинамид рибозид киназаһы; NMNAT, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансферазаһы; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилазаһы. (С) t-SNE scRNA-seq асцит (һоро) һәм шеш (ҡыҙыл; n = 3 пациенттар). (D) NNMT экспрессияһы төрлө күҙәнәк популяцияларында билдәләнгән ҡулланыу scRNA-seq. (Е) NNMT һәм AOX1 экспрессияһы SK-OV-3, кеше эмбриональ бөйөр (HEK) 293T, Т-күҙәнәктәр һәм МНК-эшкәртелгән Т-күҙәнәктәр. Ҡатланған һүҙбәйләнеш SK-OV-3-кә ҡарата күрһәтелгән. SEM менән экспрессия схемаһы күрһәтелгән (n = 6 һау донорҙар). 35-тән ҙурыраҡ Ct ҡиммәттәре асыҡланмаған (UD) тип иҫәпләнә. (F) 8мМ МНК менән эшкәртелгән СК-ОВ-3, НЭК293Т, Т-күҙәнәктәр һәм Т-күҙәнәктәрҙә SLC22A1 һәм SLC22A2 экспрессияһы. Ҡатланған һүҙбәйләнеш SK-OV-3-кә ҡарата күрһәтелгән. SEM менән экспрессия схемаһы күрһәтелгән (n = 6 һау донорҙар). 35-тән ҙурыраҡ Ct ҡиммәттәре асыҡланмаған (UD) тип иҫәпләнә. (G) күҙәнәк МНК содержаниеһы активлаштырылған һау донор Т күҙәнәктәрендә 72 сәғәт инкубациянан һуң МНК менән. СЭМ менән экспрессия схемаһы күрһәтелгән (n = 4 һау донорҙар).
МНК метил төркөмөн S-аденозил-1-метиониндан (SAM) никотинамидҡа (NA) никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; 3-сө һүрәт В) ярҙамында күсереп етештерелә. NNMT кешенең төрлө яман шештәрендә артыҡ экспрессиялана һәм пролиферация, инвазия һәм метастаздар менән бәйле (25-27). Яҡшыраҡ аңлау өсөн сығанағы МНК Т күҙәнәктәрендә ТМЭ, беҙ ҡулланған scRNA-seq характеристика бирергә NNMT экспрессияһы күҙәнәк типтары буйынса асцит һәм шештәр өс HGSC пациенттар (таблица S5). Яҡынса 6500 күҙәнәкте анализлау күрһәтеүенсә, асцит һәм шеш мөхитендә NNMT экспрессияһы фаразланған фибробласт һәм шеш күҙәнәктәре популяциялары менән сикләнгән (3-сө һүрәт, С һәм D). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: PTPRC (CD45 +) экспрессиялаусы бер ниндәй ҙә популяцияла асыҡ NNMT экспрессияһы юҡ (3D һүрәте һәм S5A һүрәте), был метаболит спектрында асыҡланған МНК-ның Т-күҙәнәктәргә индерелеүен күрһәтә. альдегид оксидаза 1 (AOX1) экспрессияһы МНК-ны 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамидҡа (2-ПИР) йәки 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамидҡа (4-ПИР) үҙгәртә; 3В һүрәте) шулай уҡ COL1A1 экспрессиялаусы фибробласттар популяцияһы менән сикләнә (S5А һүрәте), улар бергә Т-күҙәнәктәрҙең ғәҙәти МНК алмашыныу һәләтенә эйә булмауын күрһәтә. Был гендар экспрессия схемаһы МНК-ҡағылышлы раҫланды, икенсе бойондороҡһоҙ күҙәнәк мәғлүмәттәре йыйылмаһы ҡулланып, асцит HGSC пациенттарҙан (һүрәт S5B; n = 6) (16). Бынан тыш, миҡдарлы полимераз сылбырлы реакция (qPCR) анализы һау донор Т-күҙәнәктәре менән эшкәртелгән МНК күрһәткәнсә, контроль менән сағыштырғанда SK-OV-3 ятырлыҡ шеш күҙәнәктәре, NNMT йәки AOX1 тиерлек экспрессироваться (һүрәт 3Е). Был көтөлмәгән һөҙөмтәләр МНК-ның фибробластарҙан йәки шештәрҙән ТМЭ-ла эргә-тирәләге Т-күҙәнәктәргә бүленеп сығыуы мөмкинлеген күрһәтә.
Кандидаттарға 1-ҙән 3-кә тиклемге органик катион транспортерҙары ғаиләһе (OCT1, OCT2 һәм OCT3) инә, уларҙы иреткес ташыусы 22 (SLC22) ғаиләһе (SLC22A1, SLC22A2 һәм SLC22A3) кодлай, әммә МНК-ның потенциаль транспортерҙары әлегә билдәләнмәгән (28). QPCR мРНК һау донор Т күҙәнәктәренән күрһәткән түбән экспрессия кимәле SLC22A1 әммә асыҡланмаған кимәлдә SLC22A2, был раҫланы, тип, был әҙәбиәттә элек хәбәр ителгән (һүрәт 3F) (29). Ҡаршылыҡлы, SK-OV-3 йомортҡалыҡ шеш күҙәнәк һыҙығы ике транспортер юғары кимәлдә белдергән (һүрәт 3F).
Т-күҙәнәктәрҙең сит МНК-ны үҙләштереү һәләтенә эйә булыуын тикшерер өсөн һау донор Т-күҙәнәктәрен 72 сәғәт дауамында төрлө концентрациялағы МНК булғанда үҫтерәләр. Экзоген МНК булмағанда, МНК-ның күҙәнәк составын асыҡлап булмай (3-сө һүрәт Г). Әммә экзоген МНК менән эшкәртелгән активлаштырылған Т-күҙәнәктәр күҙәнәктәрҙә МНК составының дозаға бәйле артыуын күрһәтә, 6 мМ МНК-ға тиклем (3-сө һүрәт Г). Был һөҙөмтә транспортер экспрессияһының түбән кимәленә һәм күҙәнәк эсендәге МНК алмашыныуы өсөн яуаплы төп ферменттың булмауына ҡарамаҫтан, ТИЛ-дың һаман да МНК-ны үҙләштерә алыуын күрһәтә.
Пациенттар Т-күҙәнәктәрендәге метаболиттар спектры һәм in vitro МНК-ны һеңдереүҙең тәжрибәләре яман шеш менән бәйле фибробластар (CAF) МНК бүлеп сығарыу мөмкинлеген арттыра һәм шеш күҙәнәктәре ТИЛ-дың фенотипын һәм функцияһын көйләй ала. МНК-ның Т-күҙәнәктәргә тәьҫирен билдәләү өсөн һау донор Т-күҙәнәктәре МНК булғанда йәки булмағанда in vitro әүҙемләштерелгән, уларҙы пролиферациялау һәм цитокиндар етештереү баһаланған. көндән һуң иң юғары дозала МНК өҫтәгәндән һуң, популяцияның икеләтә артыу һаны уртаса кәмегән, шул уҡ ваҡытта бөтә дозаларҙа ла әүҙемлек һаҡланған (4-се һүрәт А). Бынан тыш, экзоген МНК-ны дауалау һөҙөмтәһендә шеш некрозы факторы-α (TNFα; 4-се һүрәт В) экспресслаусы CD4 + һәм CD8 + Т-күҙәнәктәр өлөшө арта. Уның ҡарауы, күҙәнәк эсендә ИФН-γ етештереү CD4 + Т күҙәнәктәрендә һиҙелерлек кәмегән, әммә CD8 + Т күҙәнәктәрендә юҡ, интерлейкин 2-лә һиҙелерлек үҙгәрештәр булмаған (IL-2; 4-се һүрәт, С һәм D). Шуға күрә, фермент-бәйле иммуносорбент анализ (ИФА) супернатанты был МНК-эшкәртелгән Т-күҙәнәк культуралары һиҙелерлек артыуын күрһәтте TNFα, кәмеүе IFN-γ, һәм үҙгәрештәр юҡ IL-2 (һүрәт 4, E to G). . ИФН-γ кәмеүе МНК-ның Т-күҙәнәктәрҙең шешкә ҡаршы эшмәкәрлеген тормошҡа ашырыуҙа роль уйнауы мөмкинлеген күрһәтә. МНК-ның Т-күҙәнәктәр аша үткәрелгән цитотоксиклыҡҡа йоғонтоһон моделләштереү маҡсатында химер антиген рецепторы Т (FRα-CAR-T) күҙәнәктәре йәшел флуоресцент аҡһым (GFP) -CAR-T) күҙәнәктәре менән көйләнгән фолат рецепторы α һәм CAR-T (GFP) маҡсатлы һау донор периферик күҙәнәктәре мононуклеар ҡан PBMC етештерелә. CAR-T күҙәнәктәре 24 сәғәт дауамында МНК булғанда үҫтерелә, ә һуңынан кеше SK-OV-3 йомортҡалыҡ шеш күҙәнәктәре менән бергә үҫтерелә, улар фолат рецепторы α экспрессиялай, эффектор һәм маҡсатлы нисбәттә 10:1. МНК менән дауалау һөҙөмтәһендә FRα-CAR-T күҙәнәктәренең үлтереш активлығы һиҙелерлек кәмей, был аденозин менән эшкәртелгән FRα-CAR-T күҙәнәктәренә оҡшаш була (4-се һүрәт Н).
(А) Дөйөм йәшәүгә һәләтле күҙәнәктәр һаны һәм популяция икеләтә (PD) туранан-тура культуранан көнө 7. Гистограмма уртаса күрһәтә + SEM алты һау донорҙар. Кәмендә n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә мәғлүмәттәрен күрһәтә. (B - D) CD3/CD28 һәм IL-2 7 көн дауамында Т-күҙәнәктәрҙе үҙҙәренең тейешле МНК концентрацияһында әүҙемләштереү өсөн ҡулланылған. Анализ алдынан күҙәнәктәрҙе 4 сәғәт дауамында GolgiStop менән ПМА/иономицин менән стимуллаштыралар. Т-күҙәнәктәрҙә TNFα (В) экспрессияһы. Миҫал һүрәте (һул) һәм таблица мәғлүмәттәре (уң) TNFα экспрессияһы тере күҙәнәктәрҙә. Т-күҙәнәктәрҙә ИФН-γ (С) һәм ИЛ-2 (Д) экспрессияһы. Цитокиндар экспрессияһы ағым цитометрияһы ярҙамында үлсәнә. Гистограмма уртаса күрһәтә (n = 6 һау донорҙар) + SEM. Р ҡиммәтен билдәләү өсөн дисперсия һәм ҡабатланған үлсәүҙәрҙең бер яҡлы анализын ҡулланыу (*Р<0,05 һәм **Р<0,01). Кәмендә n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә мәғлүмәттәрен күрһәтә. (E to G) CD3/CD28 һәм IL-2 7 көн дауамында Т-күҙәнәктәрҙе үҙҙәренең тейешле МНК концентрацияһында әүҙемләштереү өсөн ҡулланылған. сәғәт ПМА/иономицин стимуляцияһына тиклем һәм унан һуң уртаса йыйылған. ТНФα (Е), ИФН-γ (F) һәм IL-2 (G) концентрацияһы ИФА ысулы менән үлсәнә. Гистограмма уртаса күрһәтә (n = 5 һау донорҙар) + SEM. Р ҡиммәте дисперсияның бер яҡлы анализы һәм ҡабатланған үлсәүҙәр ярҙамында билдәләнә (*Р<0,05). Нөктәле һыҙыҡ асыҡлау сиген күрһәтә. (H) Күҙәнәк лизисы анализы. FRα-CAR-T йәки GFP-CAR-T күҙәнәктәре аденозин (250 мкМ) йәки МНК (10 мМ) менән 24 сәғәт дауамында көйләнгән, йәки эшкәртелмәй ҡалдырылған (Ctrl). SK-OV-3 күҙәнәктәренең процент үлтерелеүе үлсәнә. Р ҡиммәте Уэлч t тесты ярҙамында билдәләнә (*Р<0,5 һәм **Р<0,01).
МНК-ға бәйле ТНФα экспрессияһын көйләүҙе механистик аңлау өсөн МНК менән эшкәртелгән Т-күҙәнәктәрҙең ТНФα мРНК-һында үҙгәрештәр баһаланды (5-се һүрәт А). МНК менән эшкәртелгән һау донор Т-күҙәнәктәре ТНФα транскрипцияһы кимәленең ике тапҡырға артыуын күрһәтә, был МНК-ның ТНФα транскрипцияһын көйләүгә бәйле булыуын күрһәтә. Был мөмкин булған көйләү механизмын тикшерергә, ике билдәле транскрипция факторҙары, улар көйләй TNFα, атап әйткәндә, активлаштырылған Т-күҙәнәк ядро ​​факторы (NFAT) һәм махсус аҡһым 1 (Sp1), яуап баһаланды МНК бәйләү проксималь TNFα промоутер ( 30). TNFα промоторы составында 6 билдәләнгән NFAT бәйләү урындары һәм 2 Sp1 бәйләү урындары, бер урында ҡаплана [-55 база парҙары (бп) 5'cap] (30). Хроматин иммунопреципитацияһы (ЧИП) күрһәтеүенсә, МНК менән эшкәрткәндә Sp1-ҙең TNFα промоторына бәйләнеше өс тапҡырға арта. НФАТ индереү ҙә артты һәм әһәмиәткә яҡынлашты (һүрәт 5В). Был мәғлүмәттәр МНК-ның Sp1 транскрипцияһы аша TNFα экспрессияһын, ә әҙерәк кимәлдә NFAT экспрессияһын көйләүен күрһәтә.
(А) МНК-һыҙ үҫтерелгән Т-күҙәнәктәр менән сағыштырғанда, МНК менән эшкәртелгән Т-күҙәнәктәрҙә ТНФα экспрессияһының ҡатлы үҙгәреше. SEM менән экспрессия схемаһы күрһәтелгән (n = 5 һау донорҙар). Кәмендә n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә мәғлүмәттәрен күрһәтә. (Б) TNFα промотор Т-күҙәнәктәр менән эшкәртелгән йәки 8 мМ МНК һуң NFAT һәм Sp1 менән берләштерелгән (Ctrl) һәм PMA/иономицин стимуляцияһы 4 сәғәт. Иммуноглобулин G (IgG) һәм H3 иммунопреципитация өсөн ярашлы рәүештә кире һәм ыңғай контроль булараҡ ҡулланылған. ЧИП-тың миҡдарын билдәләү күрһәтеүенсә, МНК менән эшкәртелгән күҙәнәктәрҙә Sp1 һәм NFAT-тың TNFα промоторына бәйләнеше контроль күҙәнәктәр менән сағыштырғанда бер нисә тапҡырға артҡан. Кәмендә n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә мәғлүмәттәрен күрһәтә. Р ҡиммәте күп һанлы t-тестар ярҙамында билдәләнә (*** Р <0,01). (С) HGSC асцит менән сағыштырғанда, Т-күҙәнәктәр (цитотоксик булмаған) шештә ТНФ экспрессияһын арттырыуҙы күрһәтте. Төҫтәр төрлө пациенттарҙы күрһәтә. 300-гә тиклем осраҡлы рәүештә күрһәтелгән күҙәнәктәр алынған һәм артыҡ һүрәт төшөрөүҙе сикләү өсөн дрожь (** Padj = 0,0076). (D) Тәҡдим ителгән моделе МНК өсөн яман шеш йомортҡалыҡ. МНК ТМЭ-ла шеш күҙәнәктәрендә һәм фибробластарҙа етештерелә һәм Т-күҙәнәктәр тарафынан үҙләштерелә. МНК Sp1-ҙең TNFα промоторына бәйләнешен арттыра, был TNFα транскрипцияһының һәм TNFα цитокиндар етештереүенең артыуына килтерә. МНК шулай уҡ ИФН-γ кәмеүенә килтерә. Т-күҙәнәктәрҙең эшмәкәрлеген тормошҡа ашырыу үлтереүҙең кәмеүенә һәм шештең тиҙ үҫешенә килтерә.
Хәбәрҙәр буйынса, TNFα алғы һәм артҡы бәйле шешкә ҡаршы һәм шешкә ҡаршы эффектҡа эйә, әммә ул йомортҡалыҡ яман шешенең үҫешенә һәм метастаздарына булышлыҡ итеүҙә билдәле роль уйнай (31-33). Хәбәрҙәр буйынса, йомортҡалыҡ яман шеше менән ауырығандарҙа асцит һәм шеш туҡымаларында ТНФα концентрацияһы яҡшы сирле туҡымаларға ҡарағанда юғарыраҡ (34-36). Механизм йәһәтенән ТНФα аҡ ҡан күҙәнәктәренең әүҙемләшеүен, эшмәкәрлеген һәм пролиферацияһын көйләй, яман шеш күҙәнәктәренең фенотипын үҙгәртә ала (37, 38). Был асыҡлауҙарға ярашлы, дифференциаль ген экспрессияһы анализы күрһәтеүенсә, ТНФ һиҙелерлек өҫкә-көйләнгән Т күҙәнәктәрендә шеш туҡымаларында асцит менән сағыштырғанда (һүрәт 5С). ТНФ экспрессияһының артыуы цитотоксик булмаған фенотиплы Т-күҙәнәк популяцияларында ғына күренде (S5A һүрәте). Йәмғеһе, был мәғлүмәттәр МНК-ның HGSC-ла икеләтә иммуносупрессив һәм шеште үҫтереүҙең эффекты бар тигән фекерҙе хуплай.
Ағым цитометрияһына нигеҙләнгән флуоресцент маркировка ТИЛ алмашыныуын өйрәнеү өсөн төп ысулға әйләнде. Был тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, периферик ҡан лимфоциттары йәки икенсел лимфоид ағзаларҙан Т-күҙәнәктәр менән сағыштырғанда, сысҡан һәм кеше ТИЛ-дарында глюкозаны үҙләштереү тенденцияһы юғарыраҡ (4, 39) һәм митохондрия функцияһының яйлап юғалыуы (19, 40). Был тикшеренеүҙең ошондай уҡ һөҙөмтәләрен күҙәтһәк тә, төп үҫеш – бер үк резекцияланған шеш туҡымаһынан шеш күҙәнәктәре һәм ТИЛ-дың алмашыныуын сағыштырыу. Ҡайһы бер был алдағы хәбәрҙәргә ярашлы, асцит һәм шештәрҙән алынған шеш (CD45-EpCAM +) күҙәнәктәре CD8 + һәм CD4 + Т-күҙәнәктәренә ҡарағанда глюкозаның юғары ҡабул итеүенә эйә, был шеш күҙәнәктәренең глюкозаның юғары ҡабул итеүен Т-күҙәнәктәр менән сағыштырырға мөмкин тип раҫлай. Т-күҙәнәк конкуренцияһы төшөнсәһе. ТМЭ. Әммә шеш күҙәнәктәренең митохондрия эшмәкәрлеге CD8 + Т күҙәнәктәренә ҡарағанда юғарыраҡ, әммә митохондрия эшмәкәрлеге CD4 + Т күҙәнәктәренә оҡшаш. Был һөҙөмтәләр барлыҡҡа килгән теманы нығыта, тип окисландырыусы алмашыныу шеш күҙәнәктәре өсөн мөһим (41, 42). Улар шулай уҡ CD8 + Т күҙәнәктәре CD4 + Т күҙәнәктәренә ҡарағанда окисланыу дисфункцияһына һиҙгерерәк булыуы мөмкин, йәки CD4 + Т күҙәнәктәре митохондрия эшмәкәрлеген һаҡлау өсөн глюкозанан башҡа углерод сығанаҡтарын ҡуллана ала тип фаразлай (43, 44). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: беҙ асцитта CD4 + Т эффекторҙары, Т эффектор хәтере һәм Т үҙәк хәтер күҙәнәктәре араһында глюкоза алыуҙа йәки митохондрия эшмәкәрлегендә бер ниндәй ҙә айырма күҙәтмәнек. Шулай уҡ, дифференциация хәле CD8 + Т-күҙәнәктәре шештәрҙә глюкоза ҡабул итеү үҙгәрештәренә бер ниндәй ҙә бәйләнеше юҡ, әһәмиәтле айырманы айырып күрһәтә Т-күҙәнәктәре үҫтерелгән in vitro һәм кеше ТИЛ in vivo (22). Был күҙәтеүҙәр шулай уҡ автоматик күҙәнәк популяцияһын бүлеүҙе ҡулланыу менән раҫланды, был артабан CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + күҙәнәктәренең глюкоза алыуы һәм митохондрия эшмәкәрлеге шеш күҙәнәктәренә ҡарағанда юғарыраҡ булыуын асыҡланы, әммә улар Метаболизм әүҙем күҙәнәк популяцияһына эйә. Был популяция scRNA-seq анализында билдәләнгән миелоид супрессор күҙәнәктәренең йәки плазмоцитоид дендрит күҙәнәктәренең фаразланған субпопуляцияһын күрһәтә ала. Был икеһе лә кешенең йомортҡалыҡ шештәрендә хәбәр ителһә лә [45] , улар әле лә кәрәк Артабанғы эш был миелоид субпопуляцияны һүрәтләүгә ҡайтып ҡала.
Ағым цитометрияһына нигеҙләнгән ысулдар күҙәнәк типтары араһындағы глюкоза һәм окисланыу алмашыныуының дөйөм айырмаларын асыҡлай алһа ла, ТМЭ-ла митохондрия алмашыныуы өсөн глюкоза йәки башҡа углерод сығанаҡтары етештергән теүәл метаболиттар әлегә билдәләнмәгән. Метаболиттар булыуын йәки булмауын бирелгән ТИЛ подгруппаһына тәғәйенләү күҙәнәк популяцияһын ҡырҡылған туҡыманан таҙартыуҙы талап итә. Шуға күрә беҙҙең күҙәнәктәрҙе байытыу ысулы масс-спектрометрия менән бергә метаболиттар тураһында төшөнсә бирә ала, улар дифференциаль байытылған Т-күҙәнәктәр һәм шеш күҙәнәктәре популяциялары тап килгән пациент өлгөләре. Был ысулдың өҫтөнлөктәре булһа ла, флуоресценция-әүҙемләштерелгән күҙәнәктәрҙе сорттарға бүлергә, ҡайһы бер метаболит китапханалары үҙенә хас тотороҡлолоҡ һәм/йәки тиҙ әйләнеше тиҙлеге арҡаһында йоғонто яһай ала (22). Шуға ҡарамаҫтан, беҙҙең ысул ике танылған иммуносупрессив метаболитты, аденозин һәм кинуренинды асыҡлай алды, сөнки улар өлгө төрҙәре араһында ныҡ айырыла.
Беҙҙең шештәр һәм ТИЛ субтиптарын метабономик анализлау йомортҡалыҡ ТМЭ-һында метаболиттар роле тураһында күберәк төшөнсә бирә. Беренсенән, ағым цитометрияһын ҡулланып, шештәр менән CD4 + Т күҙәнәктәре араһында митохондрия эшмәкәрлегендә айырма булмауын асыҡланыҡ. Әммә LC-MS/MS анализы был популяциялар араһында метаболиттар күплегендә һиҙелерлек үҙгәрештәр асыҡлай, был ТИЛ алмашыныуы һәм уның дөйөм метаболизм эшмәкәрлеге тураһында һығымталар ентекле интерпретациялауҙы талап итеүен күрһәтә. Икенсенән, МНК — асциттағы CD45-күҙәнәктәр менән Т-күҙәнәктәр араһында иң ҙур айырма булған метаболит, шештәрҙә түгел. Шуға күрә компартментализация һәм шештең урынлашыуы ТИЛ алмашыныуына төрлөсә йоғонто яһай ала, был билдәле бер микромөхиттә мөмкин булған гетерогенлыҡты айырып күрһәтә. Өсөнсөнән, МНК етештереүсе фермент NNMT экспрессияһы башлыса CAF менән сикләнә, был шеш күҙәнәктәре әҙерәк кимәлдә, әммә асыҡлана торған МНК кимәле шештән алынған Т күҙәнәктәрендә күҙәтелә. NNMT өҫтәмә экспрессия ятырлыҡ CAF билдәле яман шеш-пропагандалау эффекты бар, өлөшләтә CAF алмашыныуына булышлыҡ итеү, шеш инвазияһы һәм метастаздар (27). ТИЛ-дың дөйөм кимәле уртаса булһа ла, КАФ-та ННМТ-ның экспрессияһы яман шеш геномы атласы (ТСГА) мезенхималь субтибы менән тығыҙ бәйле, был насар прогноз менән бәйле (27, 46, 47). Ниһайәт, МНК-ның деградацияһы өсөн яуаплы AOX1 ферментының экспрессияһы ла CAF популяцияһы менән генә сикләнә, был Т-күҙәнәктәрҙең МНК-ны алмаштырыу һәләте булмауын күрһәтә. Был һөҙөмтәләр был табышты раҫлау өсөн артабанғы эштәр кәрәк булһа ла, Т-күҙәнәктәрҙә МНК-ның юғары кимәле иммуносупрессив КАФ микромөхите булыуын күрһәтә ала тигән фекерҙе раҫлай.
МНК транспортерҙарының экспрессия кимәленең түбән булыуын һәм МНК алмашыныуында ҡатнашҡан төп аҡһымдар асыҡланмаған кимәлен иҫәпкә алғанда, Т-күҙәнәктәрҙә МНК-ның булыуы көтөлмәгән хәл. NNMT ла, AOX1 ҙә scRNA-seq анализы һәм ике бойондороҡһоҙ когортаның маҡсатлы qPCR ярҙамында асыҡлана алманы. Был һөҙөмтәләр МНК-ның Т-күҙәнәктәр тарафынан синтезланмауын, ә тирә-яҡтағы ТМЭ-нан һеңдерелеүен күрһәтә. In vitro тәжрибәләре күрһәтеүенсә, Т-күҙәнәктәр экзоген МНК тупларға ынтыла.
Беҙҙең in vitro тикшеренеүҙәре күрһәтеүенсә, экзоген МНК Т-күҙәнәктәрҙә ТНФα экспрессияһын индуцирлай һәм Sp1-ҙең ТНФα промоторына бәйләнешен көсәйтә. ТНФα шешкә ҡаршы һәм шешкә ҡаршы функцияларға эйә булһа ла, йомортҡалыҡ яман шешендә ТНФα йомортҡалыҡ яман шешенең үҫешенә булышлыҡ итә ала (31-33). Ятырлыҡ шеш күҙәнәк культураһында ТНФα нейтралләштереү йәки сысҡан моделдәрендә ТНФα сигналын бөтөрөү ТНФα-медиациялы ялҡынһыныу цитокиндарын етештереүҙе яҡшырта һәм шеш үҫешен тотҡарлай ала (32, 35). Шуға күрә, был осраҡта, ТМЭ-алынған МНК аша провоспалительный метаболит булып эшләй ала TNFα-зависимый механизмы аша аутокрин иллюминатор, шул рәүешле барлыҡҡа килгән һәм таралыуына булышлыҡ итеү яман шеш йомортҡалыҡ (31). Ошо мөмкинлеккә таянып, TNFα блокадаһы йомортҡалыҡ яман шешен дауалау өсөн потенциаль агент булараҡ өйрәнелә (37, 48, 49). Бынан тыш, МНК CAR-T күҙәнәктәренең йомортҡалыҡ шеш күҙәнәктәренә ҡарата цитотоксиклығын боҙа, был МНК-медиациялы иммун баҫтырыу өсөн артабанғы дәлилдәр бирә. Йыйынтыҡта был һөҙөмтәләр шештәр һәм КАФ күҙәнәктәре күҙәнәктән тыш ТМЭ-ға МНК бүлеп сығарыусы модель тәҡдим итә. аша (i) ТНФ-индуцированный яман шеш үҫеш стимулирование һәм (ii) МНК-индуцированный Т-күҙәнәк цитотоксик эшмәкәрлеген тормошҡа ашырыу, был икеләтә шеш эффекты булыуы мөмкин (һүрәт 5D).
Һөҙөмтәлә, тиҙ күҙәнәктәрҙе байытыу, бер күҙәнәкле секвенирование һәм метаболизм профилләштереү комбинацияһын ҡулланып, был тикшеренеүҙең HGSC пациенттарында шештәр һәм асцит күҙәнәктәре араһындағы ҙур иммунометаболомик айырмаларҙы асыҡланы. Был комплекслы анализ Т-күҙәнәктәр араһында глюкозаны үҙләштереүҙә һәм митохондрия эшмәкәрлегендә айырмалар булыуын күрһәтте һәм МНК-ны күҙәнәкһеҙ автономлы иммун көйләүсе метаболит тип билдәләне. Был мәғлүмәттәр ТМЭ-ның кеше яман шешендә Т-күҙәнәк алмашыныуына нисек йоғонто яһауына йоғонто яһай. Т-күҙәнәктәр һәм яман шеш күҙәнәктәре араһында туҡлыҡлы матдәләр өсөн туранан-тура конкуренция тураһында хәбәр ителһә лә, метаболиттар шештең прогрессив үҫешенә булышлыҡ итеү һәм, бәлки, эндоген иммун яуаптарын баҫтырыу өсөн туранан-тура көйләүселәр булып та эшләй ала. Был көйләүсе метаболиттар функциональ ролен артабан һүрәтләү шешкә ҡаршы иммун яуапты көсәйтергә альтернатив стратегиялар асырға мөмкин.
Пациент өлгөләре һәм клиник мәғлүмәттәр аша алынған BC яман шеш шеше туҡыма һаҡлағысы сертификацияланған Канада туҡыма һаҡлағысы селтәре. BC яман шеш тикшеренеүҙең этика комитеты һәм Британ Колумбияһы университеты раҫлаған протоколға ярашлы (H07-00463), бөтә пациенттар өлгөләре һәм клиник мәғлүмәттәр алынған мәғлүмәтле яҙма ризалыҡ йәки рәсми рәүештә ризалыҡтан баш тарта. Өлгөләр сертификацияланған Биобанкта (BRC-00290) һаҡлана. Ентекле пациент характеристикаһы күрһәтелгән таблицалар S1 һәм S5. Криоконсервация өсөн скальпель ярҙамында пациенттың шеш өлгөһөн механик рәүештә тарҡаталар, һуңынан уны 100 микронлыҡ фильтр аша үткәреп, бер күҙәнәкле суспензия алалар. Пациенттың асцитын 4°С температурала 10 минут дауамында 1500 әйләнеш/мин тиҙлектә центрифугалайҙар, күҙәнәктәрҙе гранулалаштыралар һәм супернатантты сығаралар. Шеш һәм асциттан алынған күҙәнәктәрҙе 50% йылылыҡ менән инактивацияланған кеше АВ ҡан һыуытҡысында (Сигма-Ольдрих), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) һәм 10% диметилсульфоксидта криоконсервациялайҙар. Был һаҡланған бер күҙәнәкле суспензиялар иретелгән һәм түбәндә һүрәтләнгән метаболомика һәм метаболиттарҙы билдәләү өсөн ҡулланылған.
Тулы мөхит 0,22 мкм фильтрланған 50:50 тулыландырылған RPMI 1640: AimV тора. 1640 + 2,05 мМ л-глутамин (Термо Фишер Сайентифик) 10% йылылыҡ менән инактивацияланған кеше АБ ҡан һыуытҡысы менән тулыландырылған (Сигма-Ольдрих), 12,5 мМ Гепес (Термо Фишер Сайентифик), 2 мМ л-глутамин (Термо Фишер Сайентик) S1. Стрептомицин (ПенСтреп) иретмәһе (Термо Фишер Сайентифик) һәм 50 мкМБ-меркаптоэтанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Гепес (Термо Фишер Сайентифик) һәм 2 мМ l-глутамин (Термо Фишер Сайентифик) менән тулыландырыла. Ағым цитометры буяу буферы 0,22 мкм фильтрланған фосфат буферлы тоҙло һыуҙан (PBS; Invitrogen) 3% йылылыҡ менән инактивацияланған АВ кеше ҡан һыуытҡысы (Сигма) тулыландырылған. Күҙәнәктәрҙе байытыу буферы 0,22 мкм фильтрланған ПФС-тан тора һәм 0,5% йылылыҡ менән инактивацияланған кеше АВ ҡан һыуытҡысы (Сигма-Ольдрих) менән тулыландырыла.
37°С тулы мөхиттә күҙәнәктәрҙе 10 нМ МТ ДР һәм 100 мкМ 2-НБДГ менән 30 минут буяйҙар. Артабан күҙәнәктәрҙе 4°С температурала 15 минут дауамында йәшәүсәнлек буяуы eF506 менән буяйҙар. Күҙәнәктәрҙе ФК блокында (eBioscience) һәм Бриллиант буяу буферында (BD Biosciences) ресуспендировать, ағым цитометры буяу буферында (етештереүсе күрһәтмәләре буйынса) һыуытып алалар һәм бүлмә температураһында 10 минут инкубациялайҙар. Күҙәнәктәрҙе антитәнсәләр йыйылмаһы менән буяу (S2 таблицаһы) ағым цитометрияһы буяу буферында 4°C температурала 20 минут. Күҙәнәктәрҙе анализ алдынан ағым цитометрияһы буяу буферында (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурацияһы) ресуспендировать. Күҙәнәктәр һаны мәғлүмәттәрен анализлау өсөн SpectroFlo һәм FlowJo V10 ҡулланығыҙ, ә мәғлүмәттәрҙе булдырыу өсөн GraphPad Prism 8 ҡулланығыҙ. 2-NBDG һәм MT DR медиана флуоресценция интенсивлығы (МФИ) лог-нормалаштырылған, ә һуңынан парлы t-тест статистик анализ өсөн ҡулланылған, тап килгән пациенттарҙы иҫәпкә алыу өсөн. 40-тан аҙыраҡ ваҡиға булған бөтә популяцияларҙы анализдан сығарыу; статистик анализ һәм мәғлүмәттәрҙе визуализациялау башҡарыр алдынан теләһә ниндәй кире ҡиммәттәр өсөн 1 МФИ ҡиммәтен индерегеҙ.
Ҡул менән ҡапҡа стратегияһын тулыландырыу маҡсатында өҫтәге процесс панелендә, беҙ форма сикләү ағасы (FAUST) (21) аша тулы аннотация ҡулланылған, автоматик рәүештә күҙәнәктәрҙе популяцияға тәғәйенләү өсөн үле күҙәнәктәрҙе бөтөрөүҙән һуң FlowJo. Беҙ ҡул менән идара итеү өсөн сығыш берләштереү өсөн популяциялар, улар, күрәһең, дөрөҫ бүленмәгән (PD1+ PD1-шеш күҙәнәктәре менән берләштереү) һәм һаҡланған популяциялар. Һәр өлгөлә уртаса 2%-тан ашыу күҙәнәк бар, дөйөм алғанда 11 популяция өсөн.
Фиколл градиент тығыҙлығы центрифугалау ҡулланылған айырыу өсөн ПБМК лейкоциттар айырыу продукттары (STEMCELL Technologies). CD8 + Т күҙәнәктәре CD8 MicroBeads (Мильтеньи) ярҙамында ПБМК-нан айырылған һәм етештереүсенең күрһәтмәләре буйынса 2 аҙна дауамында TransAct (Мильтенйи) ҡулланып тулы мөхиттә киңәйтелгән. Күҙәнәктәрҙе 5 көн буйы IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) булған тулы мөхиттә торорға рөхсәт итәләр, һуңынан TransAct менән яңынан стимуллаштыралар. 7-се көндә етештереүсенең күрһәтмәһе буйынса күҙәнәктәрҙе өс раунд рәттән байытыу өсөн кеше CD45 MicroBeads (Miltenyi) ҡулланылған. Күҙәнәктәр ағым цитометрияһы анализы өсөн аликвоталанған (өҫтә һүрәтләнгәнсә), ә LC-MS/MS анализы өсөн бер миллион күҙәнәк өс тапҡыр аликвоталанған. Өлгөләрҙе эшкәрткәндәр LC-MS/MS нисек түбәндә һүрәтләнгән. Беҙ 1000 ион һаны менән юғалған метаболит ҡиммәтен баһаланыҡ. Һәр өлгө дөйөм ион һаны (ТИС) буйынса нормалаштырыла, логарифмик үҙгәртелә һәм анализ алдынан MetaboAnalystR-ҙа автоматик рәүештә нормалаштырыла.
Һәр пациенттың бер күҙәнәкле суспензияһы иретелгән һәм 40 мкм фильтр аша тулы мөхиткә фильтрланған (өҫтә һүрәтләнгәнсә). Етештереүҙең протоколы буйынса, CD8+, CD4+ һәм CD45- күҙәнәктәре өсөн өлгөләрҙе байытыу өсөн MicroBeads (Miltenyi) ҡулланып магнитлы монстр айырыу юлы менән өс рәттән ыңғай һайлау туры рәттән ҡулланылған (боҙҙа). Ҡыҫҡаһы, күҙәнәктәр күҙәнәктәрҙе байытыу буферында (үрҙә һүрәтләнгәнсә) ресуспендировать ителә һәм иҫәпләнә. Күҙәнәктәрҙе кеше CD8 монстрҙары, кеше CD4 монстрҙары йәки кеше CD45 монстрҙары (Miltenyi) менән 4°C температурала 15 минут инкубациялайҙар, һуңынан күҙәнәктәрҙе байытыу буферы менән йыуалар. Өлгө ЛС бағанаһы (Мильтеньи) аша үткәрелә, ыңғай һәм кире фракциялар йыйыла. Оҙайлылыҡты ҡыҫҡартыу һәм күҙәнәктәрҙе тергеҙеү аҙымын максималь кимәлгә еткерер өсөн артабан CD8-фракцияһы CD4+ байытыуының икенсе туры өсөн ҡулланыла, ә CD4-фракцияһы артабанғы CD45-байытыу өсөн ҡулланыла. Айырыу процесы барышында иретмәне боҙҙа тотоғоҙ.
Метаболиттарҙы анализлау өсөн өлгөләр әҙерләү өсөн күҙәнәктәрҙе боҙ кеүек һалҡын тоҙ иретмәһе менән бер тапҡыр йыуалар, һәр өлгөгә 1 мл 80 процентлы метанол өҫтәйҙәр, һуңынан әйләндереп, шыйыҡ азотта тиҙ туңдыралар. Өлгөләрҙе өс тапҡыр туңдырыу-иретеү циклына дусар итәләр һәм 4°С температурала 15 минут дауамында 14 мең әйләнеш/мин тиҙлектә центрифугалайҙар. Метаболиттарҙы үҙ эсенә алған супернатант кипкәнсе парлана. Метаболиттарҙы 50 мкл 0,03 процентлы ҡырмыҫҡа кислотаһында яңынан иретәләр, ҡатнаштырыу өсөн әйләндерәләр, һуңынан ҡалдыҡтарҙы сығарыу өсөн центрифугалайҙар.
Метаболиттарҙы өҫтә һүрәтләнгәнсә сығарыу. Супернатантты метаболомика тикшеренеүҙәре өсөн юғары етештереүсәнлекле шыйыҡса хроматографияһы шешәһенә күсерергә. Осраҡлы дауалау протоколы ҡулланыу өсөн һәр өлгө менән дауалау оҡшаш күҙәнәктәр һаны, партия эффекттарын булдырмау өсөн. Беҙ глобаль метаболиттарҙы сифатлы баһалауҙы башҡарҙыҡ, улар быға тиклем AB SCIEX QTRAP 5500 өсләтә квадрупольлы масс-спектрометрҙа (50) баҫылып сыҡты. Хроматографик анализ һәм пик майҙандарын интеграциялау MultiQuant 2.1 версияһы программа тәьминәте (Ҡулланма биосистемалар SCIEX) ярҙамында башҡарылған.
1000 ион һаны ҡулланылған баһалау өсөн юҡ метаболит ҡиммәте, һәм һәр өлгө ТИК ҡулланылған иҫәпләү өсөн нормалаштырылған пик майҙаны һәр асыҡланған метаболит үҙгәрештәрҙе төҙәтеү өсөн индерелгән инструменталь анализ өлгө эшкәрткәндән. ТИК нормалаштырылғандан һуң, MetaboAnalystR(51) (параметр стандарт) логарифмик үҙгәртеп ҡороу һәм автоматик норма һыҙығын масштаблау өсөн ҡулланыла. Беҙ ҡулланған ПКА менән веган R пакет өлгө типтары араһында метаболом айырмалыҡтарын тикшерелгән анализ башҡарыу өсөн, һәм өлөшләтә избыточность анализы ҡулланылған пациенттарҙы анализлау өсөн. Уорд ысулын ҡулланып, өлгөләр араһындағы евклидий арауыҡты кластерлаштырыу өсөн йылылыҡ картаһы дендрограммаһын төҙөү. Беҙ лимма (52) стандартлаштырылған метаболиттар күплеге буйынса ҡулландыҡ, бөтә күҙәнәк тибы һәм микромөхит буйынса дифференциаль күплектәге метаболиттарҙы билдәләү өсөн. Аңлатманы ябайлаштырыу өсөн беҙ модель күрһәтеү өсөн төркөм уртаса параметрын ҡулланабыҙ, һәм микромөхиттәге күҙәнәк типтарын һәр төркөм тип ҡарайбыҙ (n = 6 төркөм); әһәмиәтлелек һынауы өсөн беҙ һәр метаболит өсөн өс тапҡыр ҡабатланған үлсәүҙәр үткәрҙек Ялған репликациянан ҡотолоу өсөн пациент лимма проектына ҡаршылыҡ булараҡ индерелде. Төрлө пациенттар араһында метаболиттар айырмаһын тикшерер өсөн, беҙ лимма моделен көйләйбеҙ, шул иҫәптән пациенттарҙы нығытылған ысул менән. Беҙ күҙәнәк тибы һәм Padj микромөхите араһындағы алдан билдәләнгән контрасттың әһәмиәте тураһында хәбәр итәбеҙ <0,05 (Бенджамини-Хохберг төҙәтеүе).
Һуңынан энергия байытыу ҡулланып Miltenyi Dead Cell Removal Kit (> 80% йәшәүсәнлек), бер күҙәнәкле транскриптома секвенирование дөйөм тере туңдырылған асцит һәм шеш өлгөләре ҡулланып 10x 5′ген экспрессия протоколы башҡарылған. Бер шеш өлгөһөнән түбән йәшәүсәнлек уны индереүгә ҡамасаулаһа ла, тап килгән шештәр һәм асцит менән биш осраҡ анализланған. Пациенттарҙы күп тапҡыр һайлауға өлгәшеү өсөн беҙ һәр пациенттың өлгөләрен 10x хром контролеры һыҙаттарына берләштерҙек, асцит һәм шеш урындарын айырым анализланыҡ. Һуңынан секвенирование [Illumina HiSeq 4000 28×98 н.п. парлы ос (ПЭ), Квебек геномы; уртаса 73,488 һәм 41,378 уҡый күҙәнәк өсөн шеш һәм асцит ярашлы рәүештә]], беҙ ҡулланған CellSNP һәм Vireo (53) (CellSNP нигеҙендә нисек Дөйөм кеше SNP (VCF) генотип биргән GRCh38 статусы донор идентификаторы тәғәйенләнә (Беҙ ҡулланабыҙ SNPRI идентификаторы пациент's өсөн) (IBS), тәғәйенләнмәгән күҙәнәктәрҙе һәм күҙәнәктәрҙе иҫәпкә алмағанда, асцит һәм шеш өлгөләре араһында тап килгән донорҙар билдәләнгән (54 Был бурыс нигеҙендә, беҙ шеш һәм асцитта күп күҙәнәк вәкиллеге менән анализлау өсөн нижестоящий өс осраҡта һаҡлап ҡалды (Bicoran scactor this)6. 6975 күҙәнәк бирҙе (2792 һәм 4183 күҙәнәктәр шеш һәм асцит, ярашлы рәүештә) анализ өсөн Беҙ ҡулланабыҙ igraph’s (57) Лувен кластерлаштырыу дөйөм яҡын күрше селтәре (SNN) нигеҙендә Джаккард арауыҡ кластер күҙәнәктәре аша экспрессия annota булды. һәм визуализацияланған t-SNE менән.
ПБМК лейкоциттарҙы айырыу продукттарынан (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент тығыҙлығы центрифугалау юлы менән айырылған. CD3 + күҙәнәктәре CD3 монстрҙары (Мильтенйи) ярҙамында ПБМК-нан айырылған. МНК булғанда йәки булмағанда CD3+ күҙәнәктәре пластинкаға бәйләнгән CD3 (5 мкг/мл), иретелгән CD28 (3 мкг/мл) һәм IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) менән әүҙемләштерелә. Һуңғы көндө киңәйтеү, йәшәүгә һәләтлелек (фиксированный жизнеспособность буяу eFluor450, eBioscience) һәм пролиферация (123счет eBeads, Thermo Fisher Scientific) ағым цитометрияһы ярҙамында баһаланды. Эффектор функцияһын баһалау аша күҙәнәктәрҙе стимуллаштырыу менән ПМА (20 нг/мл) һәм иономицин (1мкг/мл) менән GolgiStop 4 сәғәт, һәм монитор CD8-PerCP (РПА-Т8, БиоЛегенда), CD4-AF700 (РПА-Т4) , БиоЛегенда) һәм TNFFIrethioα i (МАб11, БД). сәғәт дауамында ПМА (20 нг/мл) һәм иономицин (1 мкг/мл) менән qPCR һәм ChIP күҙәнәктәрен стимуллаштырыу. ИФА супернатанты 4 сәғәт дауамында ПМА (20 нг/мл) һәм иономицин (1 мкг/мл) менән стимуляцияға тиклем һәм унан һуң йыйыла.
Етештереүҙең протоколы буйынса РНК-ны айырып алыу өсөн RNeasy Plus Мини-комплект (QIAGEN) ҡулланыла. Ҡулланыу QIAшредер (QIAGEN) өлгөһөн гомогенлаштырыу өсөн. Ҡулланыу өсөн юғары ҡөҙрәтле РНК кДНК комплекты (Thermo Fisher Scientific) синтезлау өсөн тулыландырыусы ДНК (кДНК). Ҡулланыу TaqMan тиҙ алдынғы мастер-микс (Термо Фишер фәнни) ген экспрессияһын һанлаштырыу өсөн (етештереүсе протоколы буйынса) түбәндәге зондтар менән: 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып глицеральдегид-3-фосфат өҫтөндә водород (ГАПДГ) тора. Өлгөләр StepOnePlus реаль ваҡытта ПЦР системаһында (Ғәмәли биосистемалар) (Ғәмәли биосистемалар) MicroAmp тиҙ оптик 96 скважиналы реакция пластинкаһында (Ғәмәли биосистемалар) MicroAmp оптик пленкаһы менән эшләтелгән. 35-тән артҡан теләһә ниндәй Ct ҡиммәте асыҡлау сигенән юғарыраҡ тип иҫәпләнә һәм асыҡланмаған тип билдәләнә.
Башҡарыу ЧИП нисек алдан һүрәтләнгән (58). Ҡыҫҡаһы, күҙәнәктәрҙе формальдегид (һуңғы концентрацияһы 1,42%) менән эшкәртәләр һәм бүлмә температураһында 10 минут инкубациялайҙар. Ҡулланыу тулыландырылған шешеү буферы (25 мМ Hepes, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl һәм 0.1% NP-40) боҙ өҫтөндә 10 минут, һуңынан иммунопреципитация буферында ресуспендировать нисек һүрәтләнгән (58 ). Һуңынан өлгө түбәндәге циклдар менән ультразвук: 10 цикл (20 1-секунд импульстары) һәм статик ваҡыт 40 секунд. Инкубировать ЧИП-класс иммуноглобулин G (күҙәнәк сигнал биреүҙең технологияһы; 1мкл), гистон Н3 (күҙәнәк сигнал биреүҙең технологияһы; 3мкл), NFAT (Invitrogen; 3мкл) һәм SP1 (күҙәнәк сигнал биреүҙең технологияһы; 3мкл) антитәнсәләр менән өлгө at°CC4night Аҡһым А монстрҙарын (Thermo Fisher Scientific) өлгө менән 4°C температурала 1 сәғәт дауамында йомшаҡ ҡына һелкетеп инкубациялайҙар, һуңынан ДНК-ны байытыу өсөн челекс монстрҙарын (Bio-Rad) ҡулланалар, ә аҡһымды үҙләштереү өсөн протеиназа К (Thermo Fisher) ҡулланалар. ТНФα промоторы ПЦР ярҙамында асыҡланған: алға, ГГГ ТАТ КСТ ТГА ТГК ТТГ ТГТ; киреһенсә, ГТГ ССА АСА АКТ ГСС ТТТ АТА ТГ (207-бп продукт). Һүрәттәрҙе Image Lab (Bio-Rad) компанияһы эшләгән һәм ImageJ программаһы ярҙамында һанлаштырған.
Күҙәнәк культураһы супернатанты өҫтә һүрәтләнгәнсә йыйылған. Билдәләү етештереүсенең кешенең ТНФα ИФА комплекты (Invitrogen), кешенең IL-2 ИФА комплекты (Invitrogen) һәм кешенең ИФН-γ ИФА комплекты (Abcam) процедуралары буйынса үткәрелгән. Етештереүҙең протоколы буйынса, супернатантты 1:100 нисбәтендә ТНФα һәм ИЛ-2, ә ИФН-γ асыҡлау өсөн 1:3 нисбәтендә һыуытҡандар. 450 нм-ҙа абсорбцияны үлсәү өсөн EnVision 2104 күп ярлыҡлы уҡыусы (ПеркинЭльмер) ҡулланыла.
ПБМК лейкоциттарҙы айырыу продукттарынан (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент тығыҙлығы центрифугалау юлы менән айырылған. CD3 + күҙәнәктәре CD3 монстрҙары (Мильтенйи) ярҙамында ПБМК-нан айырылған. МНК булғанда йәки булмағанда CD3+ күҙәнәктәре 3 көн дауамында пластинкаға бәйләнгән CD3 (5 мкг/мл), иретелгән CD28 (3 мкг/мл) һәм IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) менән әүҙемләштерелә. көндән һуң күҙәнәктәрҙе йыйып, 0,9 процентлы тоҙло һыу менән йыуалар, ә пеллетты тиҙ туңдыралар. 123 һанлы eBeads ҡулланып күҙәнәктәр һаны ағым цитометрияһы (Cytek Аврора; 3L-16V-14B-8R конфигурацияһы) ярҙамында башҡарылған.
Метаболиттарҙы өҫтә һүрәтләнгәнсә сығарыу. Киптерелгән экстракт 4000 күҙәнәк эквиваленты/мкл концентрацияһында тергеҙелә. Өлгөһөн кире фазалы хроматография (1290 Инфинити II, Агилент технологиялары, Санта-Клара, Калифорния) һәм CORTECS Т3 колонкаһы (2,1 × 150 мм, киҫәксәләр ҙурлығы 1,6 мкм, поралар ҙурлығы 120-Å; #186008500) ярҙамында анализлау. Поляр масс-спектрометр (6470, Agilent), унда электроспрей ионизацияһы ыңғай режимда эшләй. А күсмә фазаһы 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһы (H2O-ла), В күсмә фазаһы 90% ацетонитрил, 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһы тәшкил итә. LC градиент 0 2 минут өсөн 100% А, 2 7,1 минут өсөн 99% В, һәм 7,1 8 минут өсөн 99% В. Һуңынан яңынан баланслаштырыу колонка менән күсмә фаза А тиҙлеге 0,6 мл/мин 3 минут. . Ағым тиҙлеге 0,4 мл/мин, ә колонка камераһы 50°С тиклем йылытыла. Ҡулланыу МНА’s таҙа химик стандарт (M320995, Торонто тикшеренеүҙең химик компанияһы, Төньяҡ Йорк, Онтарио, Канада) билдәләү өсөн һаҡлау ваҡыты (РТ) һәм үҙгәртеп ҡороу (РТ = 0.882 минут, үҙгәртеп ҡороу 1 = 137→94.1, үҙгәртеп ҡороу 2 = 137→версия→373). Өс күсеү ҙә дөрөҫ һаҡлау ваҡытында булғанда, 1-се күсеү спецификлыҡты тәьмин итеү өсөн миҡдарҙы билдәләү өсөн ҡулланыла. Стандарт ҡойроғо МНК (Торонто тикшеренеу химия компанияһы) генерацияланған алты сериялы һыуытҡыс запас иретмәһе (1 мг/мл) стандарттар алыу өсөн 0,1, 1,0, 10 һәм 100 нг/мл һәм 1,0 һәм 10мкг/мл ярашлы шыйыҡса. Асыҡлау сиге 1 нг/мл, ә һыҙыҡлы яуап 10 нг/мл һәм 10 мкг/мл араһында. Һәр инъекция ике микролитр өлгө һәм стандарт LC/MS анализ өсөн ҡулланыла, һәм ҡатнаш сифат контроле өлгөһө йүгерә һәр һигеҙ инъекция тотороҡлолоғон тәьмин итеү өсөн анализ платформаһы. МНК яуаптар бөтә МНК-эшкәртелгән күҙәнәк өлгөләре анализ һыҙыҡлы диапазонында булды. Мәғлүмәттәрҙе анализлау MassHunter миҡдар анализы программаһы (v9.0, Agilent) ярҙамында башҡарылған.
Икенсе быуын αFR-CAR конструкцияһы Song һ.б. (59). Ҡыҫҡаһы, конструкцияла түбәндәге йөкмәтке бар: CD8a лидер эҙмә-эҙлеге, кешенең αFR-ға хас бер сылбырлы үҙгәрмәй торған фрагменты, CD8a шарниры һәм трансмембраналы өлкәһе, CD27 күҙәнәк эсендәге домены һәм CD3z күҙәнәк эсендәге домены. Тулы CAR эҙмә-эҙлеклелеге GenScript ярҙамында синтезлана, һуңынан трансдукция һөҙөмтәлелеген баһалау өсөн ҡулланылған GFP экспрессия кассетаһынан өҫкәрәк икенсе быуын лентивирус экспрессия векторына клонлана.
Лентивирус HEK293T күҙәнәктәрен трансфекциялау юлы менән етештерелә [Америка тип культураһы коллекцияһы (ATCC); 10% һыйыр ҡан һыуытҡысы (FBS) һәм 1% PenStrep составындағы Дульбекконың модификацияланған бөркөт уртаһында үҫтерелә һәм CAR-GFP векторы ҡулланыла һәм Ҡаплау плазмидалары (psPAX2 һәм pMD2.G, Addgene) липофекция аминын (Сигма-Ольдрих) ҡуллана. Вируслы супернатант трансфекциянан һуң 48 һәм 72 сәғәт үткәс йыйыла, фильтрлана һәм ультрацентрифугалау юлы менән концентрациялана. Концентрацияланған вирус супернатантын трансдукцияға тиклем -80°С температурала һаҡларға.
ПБМК һау донор лейкоциттарын айырыу продукттарынан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тығыҙлығы центрифугалау юлы менән айырыла. CD8+ күҙәнәктәрен ПБМК-нан айырыу өсөн ыңғай һайлау CD8 микрошарҙарын (Miltenyi) ҡулланыу. Т-күҙәнәктәрҙе ТрансАкт (Мильтеньи) һәм TexMACS мөхитендә [Мильтеньи; 3% йылылыҡ менән инактивацияланған кеше ҡан һыуытҡысы, 1% PenStrep һәм IL-2 (300 Е/мл) менән тулыландырыла]. Стимулациянан һуң егерме дүрт сәғәт үткәс, Т-күҙәнәктәрҙе лентивирус менән трансдукциялайҙар (106 күҙәнәккә 10 мкл концентрацияланған вирус супернатанты). 1 3 көндән һуң трансдукция Cytek Аврора (FSC (Алға таратыу)/SSC (Ян таратыу), Singlet, GFP+), күҙәнәктәрҙең GFP экспрессияһын баһалау өсөн трансдукция һөҙөмтәлелеген кәмендә 30% .
CAR-T күҙәнәктәрен 24 сәғәт дауамында Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep менән тулыландырылған) ҡоролмаһында түбәндәге шарттарҙа үҫтерәләр: эшкәртелмәгән, 250 мкМ аденозин йәки 10 мМ МНК менән эшкәртелгән. Алдан эшкәрткәндән һуң CAR-T күҙәнәктәрен PBS менән йыуалар һәм 20 мең SK-OV-3 күҙәнәктәре менән берләштерәләр [ATCC; 10% FBS һәм 1% PenStrep менән тулыландырылған Маккой 5А уртаса (Сигма-Ольдрих) 10: Эффектор һәм маҡсатлы нисбәт 1 өс тапҡыр көсәйтелгән тулыландырылған Immunocult уртаса. SK-OV-3 күҙәнәктәре һәм SK-OV-3 күҙәнәктәре digitalis сапонин менән лизланған (0,5 мг/мл; Сигма-Ольдрих) ярашлы рәүештә кире һәм ыңғай контроль булараҡ ҡулланылған. сәғәт бергә үҫтергәндән һуң, супернатант йыйыла һәм етештереүсенең күрһәтмәләре буйынса лактатдегидрогеназа (ЛДГ) үлсәнә (ЛДГ Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). ЛДГ супернатанты ЛДГ буферында 1:50 нисбәтендә һыуытылған. Үлтереүҙең проценты түбәндәге формула буйынса үлсәнә: үлтереүҙең проценты = төҙәтеүҙең проценты / үлтереүҙең максималь кимәле х 100%, унда төҙәтеүҙең проценты = тик бергә культура-Т-күҙәнәктәр, ә үлтереүҙең максималь кимәле = ыңғай контроль-тиҫкәре контроль.
Текста йәки материалдарҙа һәм ысулдарҙа һүрәтләнгәнсә, статистик анализ өсөн GraphPad Prism 8, Microsoft Excel йәки R v3.6.0 программаларын ҡулланығыҙ. Әгәр бер үк пациенттан бер нисә өлгө йыйыла (мәҫәлән, асцит һәм шеш), беҙ парлы t-тест ҡулланабыҙ йәки пациентты осраҡлы эффект булараҡ һыҙыҡлы йәки дөйөмләштерелгән модель тейешле рәүештә индерәбеҙ. Метаболомия анализы өсөн әһәмиәтлелек һынауы өс тапҡыр башҡарыла.
Был мәҡәлә өсөн өҫтәмә материалдарҙы ҡарағыҙ:
Был асыҡ рөхсәт мәҡәләһе Creative Commons атрибуция-коммерцияға ҡарамаған лицензия шарттары буйынса таратыла, был теләһә ниндәй сараларҙа ҡулланыу, таратыу һәм ҡабатлау мөмкинлеген бирә, әгәр ҙә һуңғы ҡулланыу коммерция файҙаһы өсөн түгел һәм премия булып тора, тип, төп эш дөрөҫ. Һылтанма.
Иҫкәрмә: Беҙ һеҙҙең электрон почта адресығыҙҙы бирергә генә һорайбыҙ, һеҙ биткә кәңәш иткән кеше белә, һеҙ уларҙы күрергә теләйем, электрон почта һәм был спам түгел. Беҙ бер ниндәй ҙә электрон почта адрестарын тотмаясаҡбыҙ.
Был һорау һеҙҙең ҡунаҡ булыуын тикшерергә һәм автоматик спам тапшырыуҙы булдырмау өсөн ҡулланыла.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг). (Расселл Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНК Т-күҙәнәктәрҙең иммун баҫтырылыуына булышлыҡ итә һәм кеше яман шешен дауалау өсөн потенциаль иммунотерапия маҡсаты булып тора.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг). (Расселл Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНК Т-күҙәнәктәрҙең иммун баҫтырылыуына булышлыҡ итә һәм кеше яман шешен дауалау өсөн потенциаль иммунотерапия маҡсаты булып тора.
©2021 Фәнде үҫтереүҙең Америка ассоциацияһы. бөтә хоҡуҡтары һаҡлана. АААС — ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф һәм КАУНТЕР компанияларының партнеры. 2375-2548 ISSN.