Секретор юлда аҡһымдарҙы сорттарға айырыу күҙәнәктәрҙең компартментацияһын һәм гомеостазын һаҡлау өсөн мөһим. Ҡабырсаҡ ярҙамында сортлауҙан тыш, секретор транспорт процесында кинезинды сортлауҙа липидтар роле күптәнге төп һорау булып тора, уға әлегә яуап бирелмәгән. Бында, беҙ 3D бер үк ваҡытта күп төҫлө юғары асыҡлыҡтағы реаль ваҡытта һүрәт төшөрөү башҡарыу өсөн иҫбатлау өсөн in vivo яңы синтезланған гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизированный аҡһымдар менән бик оҙон керамид липид өлөштәре кластерлаштырылған һәм махсуслаштырылған эндоплазмаларға классификацияланған Net transmbraneme сығыу сайты тарафынан төрлө, тип. Бынан тыш, беҙ күрһәтәбеҙ, тип сылбыр оҙонлоғо керамид эндоплазматик селтәр мембранаһы өсөн тәнҡитле был сорттарға һайлап алыу. Беҙҙең тикшеренеүҙең тәүге туранан-тура in vivo дәлилдәрен бирә, липид сылбырының оҙонлоғона ҡарап, аҡһым йөктәрен секретор юлдағы һайлап алыу экспорт урындарына классификациялау.
Эукариот күҙәнәктәрҙә эндоплазматик селтәрҙә (ЭС) синтезланған аҡһымдарҙы тейешле күҙәнәк урынына еткерер өсөн секретор юл аша транспортлау ваҡытында сорттарға айыралар (1). Ҡайһы бер липидтар ҙа һайлап алыу сығыу нөктәһе булып хеҙмәт итә ала, уларҙы махсус мембраналы домендарға кластерлаштырыу юлы менән оҙаҡ фаразлана, был махсус аҡһымдар (2-5). Әммә был мөмкин булған липидтарға нигеҙләнгән механизмды иҫбатлаусы туранан-тура in vivo дәлилдәре әлегә етмәй. Был төп мәсьәләне хәл итеү маҡсатында беҙ әсеткелә гликозилфосфатидилинозитолдың (ГПИ) анкерланған аҡһымдарының (ГПИ-АП) дифференциаль рәүештә ЭР-ҙан нисек сығарылыуын өйрәндек. GPI-APs липидтар менән бәйле күҙәнәк өҫтө аҡһымдарының төрлө ( 6, 7). ГПИ-АП — гликолипид өлөшө (ГПИ якорь) аша плазма мембранаһының тышҡы япраҡсаларына беркетелгән секретланған аҡһым. Улар ҡабул GPI якорь консерватив пост-трансляцион модификациялар ER люмен (8). Беркетелгәндән һуң ГПИ-АП Гольджи аппараты (5, 9) аша ЭР-ҙан плазма мембранаһына үтә. ГПИ якорҙары булыуы ГПИ-АП-ты трансмембраналы секрецияланған аҡһымдарҙан (шул иҫәптән башҡа плазма мембранаһы аҡһымдарынан) айырым секретор юл буйлап ташыуға килтерә (5, 9, 10). Әсетке күҙәнәктәрендә ГПИ-АП эндоплазматик селтәрҙәге башҡа бүленеп сыҡҡан аҡһымдарҙан айырыла, һуңынан ҡаплау аҡһым комплексы II (COPII) менән уралған уникаль везикулаларға ҡаплана (6, 7). Был классификациялау процесының детерминанттары ER экспорт процесында асыҡ түгел, әммә был механизм липидтар талап итеүе мөмкин тип фаразлана, бигерәк тә структур ремоделирование липид өлөшө GPI якорь (5, 8). Әсеткелә ГПИ липидтарын үҙгәртеп ҡороу ГПИ беркетелгәндән һуң уҡ башлана, күп осраҡта ул керамидтың 26 ​​углеродлы оҙон сылбырлы туйындырылған май кислотаһына (С26:0) бәйләнеүенә килтерә (11, 12). С26 керамиды әлегә тиклем әсетке күҙәнәктәре етештергән төп керамид булып тора. Ул ЭР-ҙа синтезлана һәм уның күпселек өлөшө Гольджи аппаратына COPII везикулалары аша сығарыла (13). ER экспорты GPI-AP махсус рәүештә дауамлы керамид синтезы талап итә (14, 15), һәм үҙ сиратында, керамид инозитол фосфат керамид (IPC) Гольджи аппаратында үҙгәртеп ҡороу GPI якорь синтезына бәйле (16). Яһалма мембраналар менән биофизик тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, бик оҙон ацил сылбырлы керамидтар үҙенсәлекле физик үҙенсәлектәргә эйә тәртипле домендар барлыҡҡа килтереп берләшә ала (17, 18). Был мәғлүмәттәр гипотезаға килтерә, тип C26 керамид һәм GPI-AP менән C26 керамид үҙҙәренең физик үҙенсәлектәрен ҡулланып, тәртипле төбәктәргә йәки төбәктәргә берләшергә сағыштырмаса бысраҡ ER мембрана липид мөхитендә. Башлыса ҡыҫҡа һәм туйындырылмаған глицеролипидтарҙан (С16:1 һәм С18:1) тора (19, 20). Был төбәктәрҙә һайлап алыу йүнәлтелгән буласаҡ аныҡ ER сығыу урындары (ERES), унда керамид һәм керамид нигеҙендә GPI-AP бергә ташыу мөмкин Гольджи бер үк бағышланған COPII везикула (5).
Был тикшеренеүҙең, беҙ туранан-тура был липидтар нигеҙендә механизмын тикшерҙе, ҡулланыу супер-сиселеш конфокаль реаль ваҡытта образдар микроскопияһы (SCLIM), был ҡырҡыу микроскопия ысулы, бер үк ваҡытта күҙәтә ала флуоресцентный маркировкаланған аҡһымдар Өс төҫлө һәм өс үлсәмле lipelu юғары resolution һәм images in (3D) (21, 22).
Беҙ тәүҙә SCLIM технологияһын ҡулланып, артабан билдәләү өсөн, нисек нормаль GPI-AP менән C26 керамид төркөмө скрининг трансмембраналы секретированный аҡһымдар ҡалдырғандан һуң ER S. cerevisiae. ER классификацияһын тикшерер өсөн, беҙ генетик система ҡулланды, туранан-тура визуализациялай ала яңы синтезланған йөк инә ERES in vivo (7, 23). Йөк булараҡ, беҙ һайланыҡ C26 керамид нигеҙендә GPI-AP Gas1 йәшел флуоресцентный аҡһым (GFP) һәм трансмембранный секретированный аҡһым Mid2 менән билдәләнгән яҡын инфраҡыҙыл флуоресцентный аҡһым (iRFP), улар икеһе лә маҡсатлы плазма мембранаһы (24-26). sec31-1 температураға һиҙгер мутантында был ике йөк галактоза индуцирлаусы промотор һәм конститутив ERES маркеры аҫтында экспрессиялана. Экстремаль температурала (37°C), сөнки sec31-1 мутацияһы COPII ҡатлам компоненты Sec31 функцияһына йоғонто яһай, COPII шытым һәм ER экспортын тормошҡа ашырыуҙы тормошҡа ашырыу өсөн, яңы синтезланған йөк ER-ҙа туплана (23). Түбән температураға (24°С) һыуытылғандан һуң sec31-1 мутант күҙәнәктәре секретор өлкәһенән тергеҙелә, тупланған яңы синтетик йөк ЭР-ҙан сығарыла башлай. CLIM визуализацияһы күрһәтеүенсә, яңы синтезланған Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP-ның күпселеге һаман да sec31-1 мутант күҙәнәктәренең ER-ында 37°C температурала инкубациянан һуң туплана, һуңынан 24°C температурала 5 минут дауамында сығарыла (1-се һүрәт). Mid2-iRFP бөтә ER мембранаһында таралғанлыҡтан, ә Gas1-GFP өҙлөкһөҙ ER мембранаһы майҙанында тупланған һәм йыйылғанлыҡтан, уларҙы таралыу бөтөнләй икенсе (1-се һүрәт, А-нан С-ҡа тиклем һәм Movie S1). Бынан тыш, 1D һүрәттә күрһәтелгәнсә, Gas1-GFP кластерында Mid2-iRFP юҡ. Был һөҙөмтәләр GPI-AP һәм трансмембраналы аҡһымдар төрлө ER мембраналы төбәктәргә иртә айырылғанын күрһәтә. Gas1-GFP кластеры mCherry COPII ҡатлам аҡһымы Sec13 менән маркировкаланған аныҡ ERES эргәһендә (1-се һүрәт, Е һәм F, һәм S1 фильмы) (23).
sec31-1 күҙәнәктәре экспресс галактоза-индуцированный секреция, оҙон ацил сылбыр (С26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, йәшел) һәм трансмембранный аҡһым Mid2-iRFP (ТМП, күк) һәм был Конструктив ERES маркировка Sec13-mCherry өсөн magenta30 (2000 йылда булды). минут үткәс, 24°C температураға күсерелә һәм 5 минуттан һуң SCLIM ярҙамында төшөрөлгән. (А - С) күрһәтә вәкиллекле берләштерелгән йәки бер 2D һүрәте яҫылыҡ (А), 2D проекция һүрәте 10 z-бүлектәр (В) йәки 3D күҙәнәк ярымшар һүрәте йөк һәм ERES маркерҙары (С). Масштаб бар 1мкм (А и В). Масштаб берәмеге 0,551 мкм (С) тәшкил итә. Gas1-GFP дискрет ER төбәктәрендә йәки кластерҙарҙа асыҡланған, ә Mid2-iRFP асыҡланған һәм бөтә ER мембранаһы буйлап таралған (С). (D) График күрһәтә, сағыштырмаса флуоресценция интенсивлығы Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP Gas1-GFP кластеры буйлап аҡ уҡ һыҙығы (һул). АУ, үҙ теләге менән берәмек. (Е һәм F) тауар һәм ERES билдәһен берләштергән 3D һүрәтте күрһәтә. Специфик ЭРЭС янында Gas1-GFP кластерҙары асыҡланған. Масштаб берәмеге 0,551 мкм тәшкил итә. (F) Аҡ ҡаты уҡ ERES менән бәйле Gas1-GFP кластерын билдәләй. Урта һәм уң панелдәрҙә берләштерелгән ҙурайтылған 3D һүрәте һәм һайланған Gas1-GFP кластерының әйләндерелгән күренеше күрһәтелгән.
Gas1-GFP кластеры һәм аныҡ ERES араһындағы тығыҙ киңлек бәйләнеше Gas1-GFP һайлап алыу ERES-ҡа инә алыуын күрһәтә, был Mid2-iRFP тарафынан ER-ҙан сығыу өсөн ҡулланылған һайлап алыусанлыҡтан айырыла. Был мөмкинлекте хәл итеү өсөн беҙ бер-ике тауар өсөн генә ERES нисбәтен һанлаштырҙыҡ (2-се һүрәт, А-нан С-ға тиклем). Беҙ күпселек ЭРЭС-тарҙа (70%) йөктөң бер генә төрө булыуын асыҡланыҡ. 2С һүрәтенең аҫҡы һүрәтендә ERES-тың ике типик миҫалы күрһәтелгән, унда тик Gas1-GFP (1-се һүрәт) йәки тик Mid2-iRFP (2-се һүрәт) бар. Ә бына яҡынса 20% ЭРЭС-та бер үк майҙанда ҡапланған ике йөк бар. Ҡайһы бер ЭРЭС-тарҙа (10%) ике төрлө йөк булыуы асыҡланған, әммә улар асыҡтан-асыҡ төрлө урындарҙа айырымланған. Шуға күрә был статистик анализ күрһәтеүенсә, ER экспортҡа сығарылғандан һуң, GPI-AP Gas1-GFP һәм трансмембраналы йөк Mid2-iRFP төрлө ERES-ҡа бүленә (2D һүрәте). Был сорттарға айырыу һөҙөмтәлелеге элекке биохимик анализ (6) һәм морфологик билдәләү (7) менән бик тап килә. Беҙ шулай уҡ ERES-ҡа ингән карантинға ҡуйылған йөктөң тәртибен күҙәтә алабыҙ (2Е һүрәте һәм S2 фильмы). 2Е һүрәтендә күрһәтелгәнсә, Gas1-GFP (3-сө панель) йәки Mid2-iRFP (4-се панель) өлөшө генә бер яҡтан ЭРЭС-ҡа инә һәм дискрет майҙанда сикләнә. 2Е һүрәтенең 5-се панелендә күрһәтелгәнсә, Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP ҡайһы саҡта бер үк ERES-та осрай, әммә улар төрлө яҡтан инә һәм айырым төбәктәрҙә туплана, улар төрлө COPII везикулаларын күрһәтә ала. Беҙ шулай уҡ раҫланы, күҙәтелгән айырыу һәм классификациялау C26 керамид нигеҙендә GPI-AP Gas1 һайлап алыу ERES аныҡ, сөнки башҡа трансмембранный секреция йөк, GFP-билдәләнгән плазма мембранаһы аҡһым Axl2 (27 ), оҡшаш тәртип күрһәтеү Mid2-iRFP. (S1 һүрәте һәм S3 фильмы). Яңы синтезланған Axl2-GFP ER мембранаһы аша тарала, Mid2-iRFP кеүек (һүрәт S1, А һәм В), һәм күпселек ERES-та Mid2-iRFP менән бергә локалләшә (S1, В-нан D-ға тиклем). 1-се һәм 2-се панелдәр 1-се һүрәттә. S1C ERES-тың ике типик миҫалын күрһәтә, унда ике трансмембраналы йөк ҡаплана. Был осраҡтарҙа ике тауар ҙа бергә ЭРЭС-ҡа инә (S1E һүрәте, 3-сө панель һәм S3 фильмы).
1-се күҙәнәктәр галактоза индуцируемый секрецияларҙы экспрессировать, Gas1-GFP (GPI-AP, йәшел) һәм Mid2-iRFP (ТМП, күк) һәм конститутив ERES маркировка Sec13-mCherry (ERES, пурпурный) 37 Һуң инкубация өсөн секрет °C °4 release move. блок, һәм һүрәт менән SCLIM 20 минуттан һуң. (А - С) Вәкиллекле 2D проекция һүрәттәре (А; масштаб бар, 1мкм) йәки 3D күҙәнәк ярымшар һүрәттәре (В һәм С; масштаб берәмеге, 0.456мкм) йөк һәм 10 z-бүлектәр билдәләнгән ERES. Аҫҡы панелдә (В) һәм панелдә (С) дисплей эшкәртелгән һүрәттәрҙе күрһәтеү өсөн тик тауарҙар бар ERES (магента) [Gas1-GFP (һоро) һәм Mid2-iRFP (асыҡ күк)]. (С) Асыҡ уҡ: ЭРЭС бер генә йөк ташый (1-ҙән 4-кә тиклем). Һоро уҡ: ЭРЭС-та айырымланған йөк бар (5). Аҡ ҡаты уҡ: ERES составында бергә урынлашҡан йөк. Түбәндә: Һайланған берҙән-бер ЭРЭС-та тик Газ1-ГФП (1) йәки Мид2-иРФП (2) бар. Масштаб бар, 100 нм. (D) һанлы фотомикрография һүрәтләнгән (C). Уртаса проценты ERES, унда бер генә йөк (Gas1-GFP йәки Mid2-iRFP), айырымланған йөк һәм ҡапланған йөк. Өс бойондороҡһоҙ тәжрибәлә 54 күҙәнәктә n=432. Хаталар һыҙығы = SD. Ике ҡойроҡло парһыҙ t-тест. *** Р = 0,0002. (Е) 3D һүрәте һайланған ERES карантинға йөк билдәләнгән (С). Gas1-GFP (йәшел) (3) йәки Mid2-iRFP (күк) (4) бер яҡтан ЭРЭС-ҡа (магент) инә һәм ЭРЭС эсендәге бәләкәй генә майҙан менән сикләнә. Ҡайһы берҙә ике төр йөк тә бер үк ЭРЭС-ҡа (5) бер яҡтан инә һәм ЭРЭС эсендәге айырымланған урынға сикләнә. Масштаб бар, 100 нм.
Артабан беҙ гипотезаны тикшерҙек, тип оҙон ацил сылбырлы керамид (С26) ER мембранаһында булған драйверҙар махсус кластерлаштырыу һәм сорттарға Gas1 һайлап алыу ERES. Бының өсөн беҙ үҙгәртелгән әсетке штаммы GhLag1 ҡулланған, унда ике эндоген керамид синтазалары Lag1 һәм Lac1 GhLag1 (мамыҡтың Lag1 гомологы) менән алмаштырылған, һөҙөмтәлә күҙәнәк мембранаһы менән әсетке штаммы Ceramide штаммы ҡырағай типтан ҡыҫҡараҡ (һүрәт 3А) (2). Масс-спектрометрия (МС) анализы күрһәтеүенсә, ҡырағай типтағы штаммдарҙа дөйөм керамидтың 95% бик оҙон (С26) сылбырлы керамид, ә GhLag1-ҙә керамидтың 85% бик оҙон (С18 һәм С16). ), ни бары 2% керамид бик оҙон (С26) сылбырлы керамид. С18 һәм С16 керамидтары әлегә тиклем GhLag1 мембранаһында асыҡланған төп керамидтар булһа ла, МС анализы шулай уҡ GhLag1 штаммында экспрессияланған Gas1-GFP-ның GPI якорында ҡырағай типтағы липидтар менән сағыштырырлыҡ С26 керамиды булыуын раҫланы. Сифаты шул уҡ (3-сө һүрәт А) (26). Шуға күрә, был тигәнде аңлата, керамид ремоделирование фермент Cwh43 юғары һайлап алыу өсөн C26 керамид, һүрәттә күрһәтелгәнсә, 26, ул өҫтөнлөк индерә GPI якорь аҙ күләмдә C26 керамид GhLag1 штамм. С2 (29). Шуға ҡарамаҫтан, GhLag1 күҙәнәк мембранаһында, нигеҙҙә, тик С18-С16 керамиды ғына бар, ә Gas1-GFP-ла һаман да С26 керамиды бар. Был факт был штаммды махсус рәүештә ЭР-ҙа мембраналы керамидтың ацил сылбырының оҙонлоғо мәсьәләһен хәл итеү өсөн идеаль ҡоралға әйләндерә. Класс һәм сорттарға бүлеүҙең гипотезалы роле. Һуңынан, беҙ тәүҙә өйрәнеү мөмкинлеге C26 Gas1-GFP кластерҙарҙа тупланыу өсөн GhLag1 температураға һиҙгер мутант аллеле sec31-1 аша ғәҙәти флуоресценция микроскопияһы, унда тик оҙон (C18-C16) сылбыр бар ER мембранаһы Керамид (һүрәт. 3). Беҙ күҙәткәнсә, sec31-1, күпселек Gas1-GFP кластерҙарҙа тупланған, ә Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 менән оҙон (C18-C16) оҙон керамид ER мембранаһы башлыса кластерлаштырылған түгел һәм таралған Бөтә ER мембранаһында. Дөрөҫөрәге, сөнки C26 керамид нигеҙендә кластерлаштырыу тығыҙ бәйле аныҡ ERES (һүрәт 1), беҙ артабан тикшерҙе, был процесс шулай уҡ ER экспорт аҡһым механизмы функцияһын үҙ эсенә аламы. GPI-AP махсус COPII системаһын ҡуллана ER экспорты өсөн, был әүҙем көйләнә Ted1′s структур ремоделирование гликан өлөшө GPI якорь (30, 31). Һуңынан рекомбинант GPI-гликан трансмембраналы йөк рецепторы p24 комплексы тарафынан таныла, ул үҙ сиратында һайлап алыу юлы менән Lst1-ҙе рекрутлай, был төп COPII йөк бәйләүсе Sec24 субъединицаһының специфик изоформаһы булып тора, GPI-AP-ға бай COPII пузырькалары кәрәк (33). Шуға күрә, беҙ был берҙән-бер аҡһымдарҙы юйыуҙы берләштергән икеләтә мутант төҙөнөк (p24 комплексы компоненты Emp24, GPI-гликан ремоделирование ферменты Ted1 һәм специфик COPII субъединица Lst1) sec31-1 мутант штаммы менән, һәм уларҙы өйрәндек Мөмкинме барлыҡҡа килтерергә GFPure Gas1-clu3 (һүрәт). Беҙ күҙәткәнсә, sec31-1emp24Δ һәм sec31-1ted1Δ, Газ1-ГФП башлыса кластерһыҙ һәм бөтә ER мембранаһы буйынса таралған, нисек элек күргән sec31-1 GhLag1, ә sec31-1lst1Δ, Газ1-GFP1 кеүек sec3. Был һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, ER мембранаһында C26 керамиды булыуҙан тыш, Gas1-GFP кластерлашыуы шулай уҡ p24 комплексына бәйләнергә тейеш, һәм махсус Lst1 рекрутинг талап итмәй. Һуңынан, беҙ ER мембранаһында керамидтың сылбыр оҙонлоғо Gas1-GFP-ның p24-кә бәйләүен көйләй алыу мөмкинлеген тикшерҙек. Әммә беҙ асыҡланыҡ, тип, мембрана C18-C16 керамид булыуы йоғонто яһамай GPI-гликандар реконструкцияланған p24 комплексы (һүрәттәр S3 һәм S4, А һәм В) йәки бәйләү GPI-AP һәм экспортлау GPI-AP. һәләт. COPII подтип Lst1 рекрут (һүрәт S4C). Шуға күрә С26 керамидҡа бәйле кластерлаштырыу төрлө ER экспорт аҡһым механизмдары менән аҡһым үҙ-ара тәьҫир итешеүен талап итмәй, әммә липидтар оҙонлоғо менән идара ителгән альтернатив сортлау механизмын хуплай. Һуңынан, беҙ анализланыҡ, ER мембранаһында керамид ацил сылбыр оҙонлоғо мөһимме, һөҙөмтәле классификациялау өсөн Gas1-GFP һайлап алыу ERES. Ҡыҫҡа сылбырлы керамид менән GhLag1 штаммындағы Gas1 ER-ҙан сығып, плазма мембранаһына ингәнгә күрә (S5 һүрәте), әгәр ҙә сортлау керамид ацил сылбырының оҙонлоғо менән идара ителә икән, GhLag1 штаммындағы Gas1-ҙе йүнәлтергә һәм киҫешергә мөмкин, тип иҫәпләйбеҙ. Шул уҡ мембраналы ЭРЭС тауарҙары.
(А) GhLag1 күҙәнәк мембранаһы башлыса ҡыҫҡараҡ C18-C16 керамидтарын үҙ эсенә ала, шул уҡ ваҡытта GPI якорь Gas1-GFP һаман да шул уҡ C26 IPC ҡырағай типтағы күҙәнәктәр кеүек. Өҫтә: ҡырағай типтағы (Wt) һәм GhLag1p штаммдарының күҙәнәк мембранаһында керамидтың масс-спектрометрия (МС) ярҙамында ацил сылбырының оҙонлоғон анализлау. Мәғлүмәттәр дөйөм керамидтың процентын күрһәтә. Өс үҙ аллы тәжрибәнең уртаса күрһәткесе. Хаталар һыҙығы = SD. Ике ҡойроҡло парһыҙ t-тест. **** Р <0,0001. Аҫҡы панелдә: MS анализ ацил сылбыр оҙонлоғо IPC булған Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI якорь ҡырағай типтағы һәм GhLag1p штаммдарында экспрессировать. Мәғлүмәттәр дөйөм ИПК сигналы процентын күрһәтә. Биш үҙ аллы тәжрибәнең уртаса күрһәткесе. Хаталар һыҙығы = SD. Ике ҡойроҡло парһыҙ t-тест. нс, мөһим түгел. Р = 0,9134. (Б) флуоресценция микрографиялары сек31-1, сек31-1 GhLag1, сек31-1emp24Δ, сек31-1ted1Δ һәм сек31-1lst1Δ күҙәнәктәре экспрессировать галактоза-индуцированный Gas1-GFP инкубировать аҫҡа 37 °C өсөн rouespyore һәм minutes3. 24°С-тан һуң үҫә. Аҡ уҡ: ЭР Газ1-ГФП кластеры. Асыҡ уҡ: Кластерһыҙ Gas1-GFP бөтә ER мембранаһы буйынса таралған, ER-ға хас ядро ​​йөҙөгө буяуын күрһәтә. Масштаб бар, 5мкм. (С) (В) һүрәтләнгән фотомикрографияның миҡдарын билдәләү. Уртаса процент күҙәнәктәр менән пунктатлы Gas1-GFP структураһы. Өс бойондороҡһоҙ тәжрибәлә n≥300 күҙәнәк. Хаталар һыҙығы = SD. Ике ҡойроҡло парһыҙ t-тест. **** Р <0,0001.
Был мәсьәләне туранан-тура хәл итеү өсөн, беҙ SCLIM визуализацияһы башҡарҙы Gas1-GFP һәм Mid2-iRFP GhLag1 менән sec31-1 температураға һиҙгер мутант аллеле (һүрәт 4 һәм фильм S4). Һуң ER һаҡланған 37°C һәм артабан 24°C сығарылған, күпселек яңы синтезланған Gas1-GFP кластерлаштырылған һәм бөтә ER мембранаһы буйлап таралған түгел, тип күҙәтелә ғәҙәти микроскоптар (һүрәт 4, А һәм В ). Бынан тыш, ҙур процент ERES (67%) үҙ эсенә ике төр йөк бергә урынлашҡан унда (һүрәт 4D). 4С һүрәтенең 1-се һәм 2-се панелдәрендә Gas1-GFP һәм Mid2-GFP ҡапланған ERES-тың ике типик миҫалы күрһәтелгән. Бынан тыш, ике тауар ҙа бер үк ЭРЭС-ҡа йыйылған (4Е һүрәте, 3-сө панель һәм S4 фильмы). Шуға күрә беҙҙең һөҙөмтәләр ER мембранаһында керамид ацил сылбырының оҙонлоғо ER аҡһымының агрегацияһы һәм классификацияһының мөһим детерминанты булыуын күрһәтә.
1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып 37°С температурала инкубациялау тора. минут дауамында, 24°C тиклем төшөп, секрецияларҙы сығарыу, һәм 20 минуттан һуң SCLIM менән һүрәт. (А - С) вәкиллекле 2D проекция һүрәттәре (А; масштаб бар, 1 мкм) йәки 3D күҙәнәк ярымшар һүрәттәре (В һәм С; масштаб берәмеге, 0.45 мкм) 10 z-бүлектәр билдәләнгән йөк һәм ERES. Аҫҡы панелдә (В) һәм панелдә (С) дисплей эшкәртелгән һүрәттәрҙе күрһәтеү өсөн тик тауарҙар бар ERES (магента) [Gas1-GFP (һоро) һәм Mid2-iRFP (асыҡ күк)]. (С) Аҡ тултырылған уҡ: ЭРЭС, тауарҙар ҡаплана. Асыҡ уҡ: ЭРЭС-та бер генә әйбер бар. Аҫҡы панелдә: Һайланған ERES ҡапланған тауарҙар бар (1 һәм 2) билдәләнгән (С). Масштаб бар, 100 нм. (D) һанлы фотомикрография һүрәтләнгән (C). sec31-1 һәм sec31-1 GhLag1 берәмектәрендә бер генә йөк (Gas1-GFP йәки Mid2-iRFP) инә, ә айырымланған йөк һәм ҡапланған йөк өсөн ЭРЭС-тың уртаса проценты. Өс бойондороҡһоҙ тәжрибәлә 54 күҙәнәктә n = 432 (сек31-1) һәм 47 күҙәнәктә n = 430 (сек31-1 GhLag1) асыҡланған. Хаталар һыҙығы = SD. Ике ҡойроҡло парһыҙ t-тест. *** Р = 0,0002 (сек31-1) һәм ** Р = 0,0031 (сек31-1 ГхЛаг1). (Е) 3D һүрәте һайланған ERES менән ҡапланған йөк (3) билдәләнгән (С). Gas1-GFP (йәшел) һәм Mid2-iRFP (күк) бер яҡтан ЭРЭС-ҡа (магента) яҡынлаша һәм бер үк ЭРЭС сикләнгән районда ҡала. Масштаб бар, 100 нм.
Был тикшеренеүҙең туранан-тура in vivo дәлилдәре бирә, липидтар нигеҙендә аҡһым йөктәре секретор юлында һайлап экспорт урындарына классификациялана, һәм классификациялау һайлап алыу өсөн ацил сылбыр оҙонлоғоноң мөһимлеген аса. Ҡөҙрәтле һәм алдынғы микроскопия ысулын ҡулланып, тип аталған SCLIM, беҙ күрһәткән яңы синтезланған Gas1-GFP (төп плазма мембранаһы GPI-AP бик оҙон ацил сылбыр (C26) керамид липид өлөшө) әсетке ) Төбәктәрҙә кластерлаштырылған дискрет transmbrame аша таралған ERs менән бәйле, . ER мембранаһы (1-се һүрәт). Бынан тыш, был ике төр тауар төрлө ЭРЭС-ҡа һайлап инә (2-се һүрәт). Мембрана күҙәнәкле керамидтың ацил сылбырының оҙонлоғо С26-нан С18-С16-ға тиклем кәмей, Gas1-GFP кластеры дискрет ER төбәгенә боҙола, ә Gas1-GFP шул уҡ ERES аша трансмембраналы аҡһым менән ER-ҙан сығыу өсөн үҙгәртелә (3-сө һүрәт һәм 3-сө һүрәт). 4).
GPI-AP махсуслаштырылған аҡһым механизмын ҡулланһа ла, ER сығыу өсөн, беҙ асыҡланыҡ, C26 керамид-зависимый айырыу дифференциаль аҡһым үҙ-ара тәьҫир итешеүгә таянмай, был ERES махсуслашыуына килтерергә мөмкин (һүрәттәр S4 һәм S5). Уның урынына беҙҙең табыштар липидтар нигеҙендәге аҡһымдарҙы кластерлаштырыу һәм артабан башҡа йөктәрҙе сығарыу ярҙамында идара ителгән альтернатив классификациялау механизмын хуплай. Беҙҙең күҙәтеүҙәр күрһәтеүенсә, Gas1-GFP төбәге йәки кластеры менән бәйле аныҡ ERES етешмәй трансмембранный секретированный аҡһым Mid2-iRFP, был күрһәтә, тип C26 керамид-зависимый GPI-AP кластеры уларҙы еңеләйтәсәк тейешле ERES инеү, һәм шул уҡ ваҡытта, был айырым encretions TheESu сығарып (TheFig1). 2). Ә ER мембранаһында C18-C16 керамидтарының булыуы GPI-AP-тың төбәктәр йәки кластерҙар барлыҡҡа килтермәй, шуға күрә улар трансмембраналы секретланған аҡһымдарҙы бер үк ERES-ҡа сығармай йәки алмаштырмай (3-сө һәм 4-се һүрәттәр). . Шуға күрә беҙ тәҡдим итәбеҙ, тип C26 керамид диск айырыу һәм классификациялау еңеләйтеү кластерлаштырыу аҡһымдар бәйле махсус ERES.
Нисек был С26 керамид-зависимый кластерлаштырыу аныҡ ER районына өлгәшергә? Мембраналы керамидтың ян-яҡтан айырылыу тенденцияһы GPI-AP һәм C26 керамидтарының ҡыҫҡараҡ һәм туйындырылмаған глицеролипидтарҙы үҙ эсенә алған ER мембранаһының тәртипһеҙерәк липид мөхитендә бәләкәй һәм мгновенно тәртиптәге липидтар барлыҡҡа килтерергә мөмкин. Сифат кластерҙары (17, 18). Был бәләкәй ваҡытлыса кластерҙарҙы р24 комплексына бәйләнгәндән һуң артабан ҙурыраҡ, тотороҡлораҡ кластерҙарға ҡушырға мөмкин (34). Был тура килә, беҙ күрһәткән, тип C26 Gas1-GFP кәрәк, тип үҙ-ара эш итеү өсөн p24 комплексы ҙурыраҡ күренгән кластерҙар барлыҡҡа килтерергә (һүрәт 3). р24 комплексы — әсеткеләге дүрт төрлө р24 трансмембраналы аҡһымдарҙан торған гетерозигот олигомер (35), ул күп ҡиммәтле бәйләнеште тәьмин итә, был бәләкәй ГПИ-АП кластерҙарының һылтанмаһына килтерергә мөмкин, шуның менән ҙурыраҡ Тотороҡло кластер барлыҡҡа килә (34). GPI-APs аҡһым эктодомендары араһындағы үҙ-ара тәьҫир итешеү ҙә уларҙы агрегациялауға булышлыҡ итә ала, уларҙы һөтимәрҙәрҙең полярлаштырылған эпителий күҙәнәктәрендә Гольджи транспорты ваҡытында күрһәтелгәнсә (36). Әммә ER мембранаһында C18-C16 керамиды булғанда, p24 комплексы Gas1-GFP менән бәйләнгәндә, ҙур айырым кластерҙар барлыҡҡа килмәйәсәк. Төп механизмы оҙон ацил сылбырлы керамидтың үҙенсәлекле физик һәм химик үҙенсәлектәренә бәйле булыуы мөмкин. Яһалма мембраналарға биофизик тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, оҙон (С24) һәм ҡыҫҡа (С18-С16) ацил сылбырлы керамидтар фаза айырылыуын сәбәпсе булһа ла, тик оҙон ацил сылбырлы керамидтар (С24) ғына юғары Кривизға һәм пленканың эйелеүенә булышлыҡ итә ала, пленканы үҙгәртеп ҡороу өсөн. Үҙ-ара һылтанма аша (17, 37, 38). Күрһәтелгән, трансмембраналы спираль TMED2, кеше гомологы Emp24, һайлап үҙ-ара тәьҫир итә C18 керамид нигеҙендә сфингомиелин цитоплазма лобулялар (39). Молекуляр динамика ҡулланып (МД) моделләштереү, беҙ асыҡланыҡ, тип, икеһе лә С18 һәм С26 керамидтар тирәләй туплана цитоплазма лобулялар Emp24 трансмембраналы спираль, һәм улар оҡшаш өҫтөнлөктәргә эйә (һүрәт S6). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: был Emp24-тең трансмембраналы спираленең мембранала липидтар асимметрик таралыуына килтерергә мөмкинлеген күрһәтә. Был һөтимәрҙәр күҙәнәктәренә нигеҙләнгән һуңғы һөҙөмтә. Оҡшаш MD моделләштереү шулай уҡ эфир липидтары булыуын күрһәтә (40) . Шуға күрә беҙ ER26-ның ике лобуляһындағы С26 керамиды локаль байытылған тип фаразлайбыҙ. Ҡасан GPI-AP люминаль лобулярҙа туранан-тура бәйләнә күп ҡиммәтле р24 һәм тупланыу C26 керамид тирәләй р24 цитоплазма лобулярында, ул ярҙам итә ала оҙатыусы Аҡһым агрегацияһы һәм мембрана кривизнаһы бармаҡтар аша генерациялана curved (41), сәбәп GPI-AP айырыу өсөн юғары районға favorja . ER мембранаһының өлкәләрендә (42). Алдағы докладтарҙа тәҡдим ителгән механизм хупланы (43, 44). Олиголектиндар, патогендар йәки керамид нигеҙендәге гликосфинголипидтарға (ГСЛ) антитәнсәләрҙең плазма мембранаһында күп ҡиммәтле бәйләнеше ҙур ГСЛ агрегацияһын башлай, фазалар айырылыуын көсәйтә һәм мембрананың деформацияһын һәм интернализацияһын тыуҙыра (44). Iwabuchi һ.б. (43) асыҡланғанса, оҙон (С24), әммә ҡыҫҡа түгел (С16) ацил сылбырҙары булғанда, GSL лактозилцерамидҡа бәйле күп ҡиммәтле лиганд ҙур кластерҙар барлыҡҡа килтереүҙе һәм мембрана инвагинацияһын индуцирлай, ә цитоплазма Лин-медиациялы нейтлиндар аша чагитропил листовкаларҙа сигнал трансдукцияһы булып тора.
Һөт имеҙеүселәрҙең полярлашҡан эпителий күҙәнәктәрендә Гольджиға ҡаршы селтәрҙең (ТГН) апикаль плазма мембранаһы кимәленә тиклем концентрацияһы ГПИ-АП-ты айырыуҙы һәм сорттарға бүлеүҙе контролдә тота (10, 45). Был агрегация двигателдәре GPI-AP олигомеризация (36), әммә ул шулай уҡ беҙ әсетке таба керамид сылбыр оҙонлоғона бәйле булыуы мөмкин. Һөт имеҙеүселәр GPI-AP эфир липидтар нигеҙендә якорь булһа ла, һәм уның химик төҙөлөшө бик оҙон ацил сылбырлы керамид бик айырыла, күптән түгел үткәрелгән тикшеренеүҙең асыҡлауынса, ике липид эволюцион яҡтан оҡшаш физик һәм химик үҙенсәлектәргә эйә Һәм функцияһы (40). Шуға күрә һөтимәрҙәр күҙәнәктәрендәге эфир липид өлөшө әсеткеләге С26 керамидына оҡшаш булыуы мөмкин, ә уның роле — мембраналағы оҙон сылбырлы керамид менән бәйләнешкә инеү, GPI-AP агрегацияһына һәм сортлауға булышлыҡ итеү. Был мөмкинлекте туранан-тура тикшерергә кәрәк булһа ла, элекке табыштар оҙон ацил сылбырлы керамидты Гольджи организмына ташыу цитоплазма күсермә аҡһымдары ярҙамында башҡарылмай, ә әсетке кеүек ГПИ якорҙары синтезына бәйле булыуын раҫлай. Шуға күрә эволюцион консерватив механизм бик оҙон ацил сылбырлы керамидты һәм ГПИ-АП-ты (13, 16, 20, 46, 47) бер үк транспорт ҡыуыҡсаһында һайлап алыу юлы менән бергә ташый ала кеүек.
Әсетке һәм һөтимәрҙәрҙең полярлашҡан эпителий күҙәнәк системаларында GPI-AP агрегацияһы һәм башҡа плазма мембранаһы аҡһымдарынан айырылыуы барыһы ла күҙәнәк өҫтөнә еткәнсе бара. Паладино и др. (48) асыҡлауынса, һөтимәрҙәрҙең полярлашҡан эпителий күҙәнәктәренең ТГН-ында ГПИ-АП кластерлаштырыу ГПИ-АП-тарҙы апикаль плазма мембранаһына һайлап классификациялау өсөн генә кәрәк түгел, ә ГПИ-АП-тарҙы кластерлаштырыуҙы ойоштороуҙы һәм Уның биологик эшмәкәрлеген көйләй. Күҙәнәк өҫтө. Әсеткелә, был тикшеренеүҙең күрһәтеүенсә, С26 керамид-зависимый GPI-AP кластеры өҫтөндә ER кластер ойоштороу һәм функциональ эшмәкәрлеген көйләй ала GPI-AP плазма мембранаһы (24, 49). Был модель менән ярашлы, GhLag1 күҙәнәктәре аллергия GPI ингибиторҙары йәки препараттар, улар күҙәнәк диуарының бөтөнлөгөнә йоғонто яһай (28), һәм функциональ Gas1-GFP кластерҙары кәрәклеге (49) ос керамид проекцияланған әсетке күҙәнәктәре йәбешеү G күрһәтә Мөмкин булған физиологик эҙемтәләр hLag1. GPI-AP хатаһы. Әммә күҙәнәк өҫтөнөң функциональ ойошторолошоноң липидтар оҙонлоғона нигеҙләнгән сорттарға айырыу ысулы менән ЭР-ҙан программаланғанмы-юҡмы икәнлеген артабан тикшерергә беҙҙең киләсәктәге тикшеренеүҙең предметы буласаҡ.
Был эштә ҡулланылған штаммдар S1 таблицаһында бирелгән. MMY1583 һәм MMY1635 штаммдары SCLIM тере күҙәнәктәрҙе һүрәтләү өсөн W303 фонында төҙөлгән. Был штаммдар экспрессировать Sec13-mCherry менән флуоресцентный аҡһым биркаһы төҙөлгән полимеразный сылбырлы реакция (ПЦР)-нигеҙендә ысул менән pFA6a плазмида шаблон булараҡ (23). GAL1 промоторы контроле аҫтында флуоресцент аҡһым менән маркировкаланған Mid2-iRFP экспрессиялаусы штамм түбәндәгесә төҙөлгән. pKTiRFP-KAN векторынан iRFP-KanMx эҙмә-эҙлеклелеген ПЦР амплификацияһы (Э. О'Ши бүләге, Addgene плазмидаһы номеры 64687; Һуңынан Mid2-iRFP геном эҙмә-эҙлеклелеге көсәйтелгән һәм GAL1 промоторына клонланған, ул pRS306 интеграция плазмидаһының Not I-Sac I сайтына интеграцияланған. Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән pRGS7 плазмидаһы Pst I менән линейлаштырылған, URA3 локусына интеграцияланған.
Gas1-GFP синтез гены центромер (CEN) плазмидаһында GAL1 промоторы контроле аҫтында экспрессиялана, ул түбәндәгесә төҙөлә. 1-се эҙмә-эҙлеклелек pRS416-GAS1-GFP плазмидаһынан ПЦР ярҙамында көсәйтелгән (Л. Пополо бүләге) һәм CEN плазмидаһының Xma I–Xho I сайтына клонланған. Миллер; 51225 һанлы адген плазмидаһы; 51225; РРИД: Ҡушымта_51225). Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән плазмидаға pRGS6 тип атала. Axl2-GFP синтез гены шулай уҡ pBEVY-GL LEU2 векторының GAL1 промоторы контроле аҫтында экспрессиялана, уның төҙөлөшө түбәндәгесә. pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидаһынан (23) ПЦР ярҙамында көсәйтелгән һәм pBEVY-GL LEU2 векторының Bam HI-Pst I урынына клонланған. Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән плазмидаға pRGS12 тип атала. Был тикшеренеүҙең эҙмә-эҙлеге S2 таблицаһында бирелгән.
Штамм 0,2% аденин һәм 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-раффиноза] бай әсетке экстракты аҡһым р (YP) уртаса (1 % Әсетке экстракты һәм 2% аҡһым ept) менән тулыландырылған. (YPR)] йәки 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] углерод сығанағы булараҡ, йәки синтетик минималь мөхиттә (0.15% әсетке азот базаһы һәм 0.5% аммиак сульфаты) тейешле аминокислоталар һәм нигеҙҙәре туҡланыу өсөн кәрәк тулыландырыу өсөн , Һәм составында 2synthetic глюкоза me2% глюкоза ( (синтетик галактоза минималь мөхит) углерод сығанағы булараҡ ҡулланыла.
Реаль ваҡытта һүрәт төшөрөү өсөн температураға һиҙгер sec31-1 мутант күҙәнәктәре GAL1 промоторы аҫтында конструкцияны экспресслаусы YPR мөхитендә 24°C температурала төнө буйы урта лог фазаһына тиклем үҫтерелгән. сәғәт YPG-ла 24°C температурала индукцияланғандан һуң, күҙәнәктәрҙе 37°C температурала SG-ла 30 минут инкубациялайҙар, һуңынан секреция блогынан сығарыу өсөн 24°C температураға күсерәләр. Конканавалин А күҙәнәктәрҙе быяла слайдҡа нығытыу өсөн ҡулланылған һәм SCLIM ярҙамында һүрәтләнгән. 100×1,4 һанлы диафрагмалы май линзаһы (Олимп), юғары тиҙлектәге һәм юғары сигнал-шум нисбәте әйләнешле диск конфокаль сканер (Йокогава Электрик һәм ҡулланыусы спектрометры), ҡулланыусы спектрометры (Хамамацу фотоникаһы) ×266,7 һуңғы ҙурайтыулы ҙурайтыусы линза системаһын һәм электрондарҙы ҡабатлаусы зарядлы ҡоролма камераһын тәьмин итә ала (Хамамацу фотоникаһы) (21). Һүрәтте алыу ҡулланыусылар өсөн программа тәьминәте (Йокогава Электрик) ярҙамында башҡарыла. 3D һүрәттәр өсөн беҙ объектив линзаһын вертикаль рәүештә тирбәтеү өсөн заказ буйынса эшләнгән пьезоэлектрик привод ҡулландыҡ, ә оптик өлөштәрҙе 100 нм алыҫлыҡта өйөмгә йыйҙыҡ. Z-стек һүрәте 3D воксел мәғлүмәттәренә үҙгәртелә, ә әйләнешле диск конфокаль микроскоп өсөн ҡулланылған теоретик нөктә таралыу функцияһы Volocity программа тәьминәте (PerkinElmer) ярҙамында деконволюция эшкәртелеүе өсөн ҡулланыла. Ҡулланыу Volocity программа тәьминәте автоматик рәүештә порог өсөн бергә урынлашҡан анализ, ERES, шул иҫәптән йөк үлсәү булды. Һыҙыҡлы сканерлау анализы MetaMorph программа тәьминәте (Молекуляр ҡоролмалары) ярҙамында башҡарылған.
Статистик әһәмиәтте билдәләү өсөн GraphPad Prism программаһын ҡулланығыҙ. Ике ҡойроҡло Студент t-тесты һәм ғәҙәти бер яҡлы дисперсия анализы (ANOVA) тесты өсөн төркөмдәр араһындағы айырмалар Р <0,05 (*) һиҙелерлек йоғонто яһай тип иҫәпләнә.
Gas1-GFP флуоресценция микроскопияһы өсөн лог фаза күҙәнәктәре YPD-ла төнө буйы үҫтерелгән һәм центрифугалау юлы менән йыйылған, фосфат буферлы тоҙло һыу менән ике тапҡыр йыуылған һәм кәмендә 15 минут боҙҙа инкубацияланған, һуңынан микроскоп аҫтында элек һүрәтләнгәнсә эшләгән (Check24). Һатып алыу өсөн объектив линзаһы, L5 (GFP) фильтры, Хамамацу камераһы һәм Application Suite X (LAS X) программа тәьминәте менән йыһазландырылған Leica DMi8 микроскобы (HCX PL APO 1003/1.40 майлы PH3 CS) ҡулланылған. .
Өлгөләрҙе 65°C температурала 10 минут дауамында SDS өлгө буферы менән денатурировать итәләр, һуңынан SDS-полиакриламид гель электрофорезы (PAGE) ярҙамында айыралар. Иммуноблоттинг анализы өсөн бер һыҙатҡа 10 мкл өлгө тейәлгән. Беренсел антитело: 1:3000 ҡатнашмаһында ҡуян поликлональ анти-Gas1, 1:500 ҡатнашмаһында ҡуян поликлональ анти-Emp24 һәм 1:3000 ҡатнашмаһында ҡуян поликлональ анти-GFP (Х.Ризмандың бүләге) ҡулланыла. Сысҡандың моноклональ анти-Pgk1 антитәнсәһе 1:5000 ҡатнашмаһында ҡулланылған (Х. де ла Круздың бүләге). Икенсел антитело: Хрен пероксидазаһы (HRP) конъюгированный кәзә анти-ҡуян иммуноглобулин G (IgG) ҡулланыла 1:3000 һыуытҡыс (Пирс). HRP-конъюгированный кәзә анти-сысҡан IgG ҡулланылған 1:3000 һыуытҡыс (Пирс). Иммун яуап зонаһы СуперСигнал Вест Пико реагенты (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценция ысулы менән күҙәтелгән.
(31) һүрәтләнгәнсә, байытылған ЭР фракцияһында тәбиғи иммунопреципитация тәжрибәһе үткәрелгән. Ҡыҫҡаһы, йыуып әсетке күҙәнәктәре менән ТНЭ буферы [50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид һәм протеаза ингибиторы ҡатнашмаһы) 600 нм ( OD600) 100 опт. Уны быяла монстрҙар менән ватҡандар, һуңынан күҙәнәк ҡалдыҡтарын һәм быяла монстрҙарын центрифугалау юлы менән сығарғандар. Артабан супернатантты 17 000 г температурала 4°С температурала 15 минут центрифугалайҙар. Пеллетты ТНЭ-ла ресуспендировать итәләр һәм digitalis сапонинын 1% һуңғы концентрацияға тиклем өҫтәйҙәр. Суспензияны 4°С температурала әйләндереп 1 сәғәт инкубациялайҙар, һуңынан иремәй торған компоненттарҙы 13 000 г 4°С температурала 60 минут центрифугалау юлы менән сығаралар. Gas1-GFP иммунопреципитацияһы өсөн тәүҙә өлгөнө буш агароза монстрҙары (ХромоТек) менән 4°С температурала 1 сәғәт алдан инкубациялайҙар, һуңынан 4°С температурала GFP-Trap_A (ХромоТек) менән 3 сәғәт инкубациялайҙар. Иммунопреципитацияланған монстрҙарҙы биш тапҡыр составында 0,2% дигоксигенин булған ТНЭ менән йыуалар, SDS өлгө буферы менән элюирлайҙар, SDS-PAGE-ла айыралар һәм иммуноблоттинг ысулы менән анализлайҙар.
(31) һүрәтләнгәнсә, байытылған ЭР фракцияһында һылтанма билдәләү башҡарылған. Ҡыҫҡаһы, байытылған ER фракцияһы 0,5 мМ дитиобис менән инкубировать(сукцинимидил пропионат) (Пирс, Термо Фишер фәнни, Рокфорд, IL, АҠШ; 20°C, 20 мин). Сшивание реакцияһы глицин өҫтәп һүндерелә (50 мМ һуңғы концентрация, 5 минут, 20°С).
Алдан һүрәтләнгәнсә (50), ҡырағай типтағы һәм GhLag1 штаммдарында керамидтың МС анализы башҡарылған. Ҡыҫҡаһы, күҙәнәктәрҙе 30°C температурала YPD-ла экспоненциаль фазаға тиклем (3-тән 4-кә тиклем OD600 берәмек/мл) үҫтерәләр, 25×107 күҙәнәктәр йыйыла. Уларҙың матдәләр алмашыныуы трихлоруксус кислотаһы менән һүндерелә. Экстракция иреткес ҡулланыу [этанол, һыу, эфир, пиридин һәм 4,2 Н аммиак гидроксиды (15:15:5:1:0,018 об/к)] һәм 1,2 нмоль эске стандарт С17 керамид (860517, Avanti поляр липид) сифаты). Монометиламин реагенты ҡулланыу [метанол, һыу, н-бутанол һәм метиламин иретмәһе (4:3:1:5 v/v)] экстракттың еңел һелтеле гидролиз башҡарыу өсөн, ә һуңынан һыу менән туйындырылған н-бутанол ҡулланыу өсөн тоҙһоҙландырыу. Ниһайәт, экстракт ыңғай режимдағы иреткестә [хлороформ/метанол/һыу (2:7:1) + 5 мМ аммиак ацетаты] ресуспендировать һәм масс-спектрометрға индерелә. Сфинголипид молекулаларын асыҡлау һәм миҡдарын билдәләү өсөн күп реакциялы мониторинг (МРМ) башҡарылған. TSQ Vantage өсөнсө квадруполь масс-спектрометры (Thermo Fisher Scientific) липидтарҙы анализлау өсөн роботлаштырылған наноағым ион сығанағы Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк штаты) менән йыһазландырылған. Бәрелеш энергияһы һәр керамид категорияһы өсөн оптимальлаштырылған. МС мәғлүмәттәре ыңғай режимда алынған. Һәр биологик реплика өсөн липид сигналы өс бойондороҡһоҙ үлсәүҙең медианаһы булып тора.
(31) һүрәтләнгәнсә, Gas1-GFP экспрессиялаусы күҙәнәктәр (800×107) тәбиғи иммунопреципитацияға дусар ителгән. Таҙартылған Gas1-GFP SDS-PAGE ярҙамында айырылған һәм поливинилиденфторид (ПВДФ) мембранаһына күсерелгән. Аҡһымды ПВДФ-ты амид ҡара төҫ менән буяу юлы менән визуалләштергәндәр. Gas1-GFP һыҙығы ПВДФ-тан ҡырҡып алынған һәм 5 тапҡыр метанол менән һәм бер тапҡыр шыйыҡ хроматография-МС (LC-MS) сортлы һыу менән йыуылған. 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфер һәм 500 мкл яңы иретелгән 1 М натрий нитриты ҡатнашмаһы менән мембраналы таҫма инкубациялау юлы менән 37°С температурала 3 сәғәт дауамында липид фракцияһы Gas1-GFP һәм лизланған cercoamisin араһында сығарыла. (51). Шунан һуң мембраналы таҫма дүрт тапҡыр LC-MS сортлы һыу менән йыуыла, бүлмә температураһында киптерелә һәм анализға тиклем -80°C температурала азот атмосфераһында һаҡлана. Контроль булараҡ, һәр тәжрибә өсөн ПВДФ мембранаһының буш өлгөһө ҡулланылған. Һуңынан липид экстракцияланған Gas1-GFP анализланған MS нисек һүрәтләнгән (50). Ҡыҫҡаһы, ПВДФ таҫмалар составында GPI-липид 75мкл кире форма иреткес [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммиак ацетат] һәм үткән электроспрей ионизация (ЭСИ)-МРМ/МС анализ сфинголипид төрҙәре (TSQ Vantage). Был осраҡта МС мәғлүмәттәре кире ион режимында алынған.
Алда әйтелгәнсә, липид өлөшө ГПИ якорь айырылған [3Н]-инозитол-маркированный ГПИ-АП (16). Липидтарҙы иреткес системаһы (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) ярҙамында йоҡа ҡатламлы хроматография ярҙамында айырып алалар һәм FLA-7000 (Fujifilm) ярҙамында визуалләштерәләр.
Gas1-GFP (600×107) экспрессиялаусы күҙәнәктәрҙе ТНЭ буферы менән ТНЭ буферы менән ике тапҡыр йыуалар, быяла монстрҙар менән өҙәләр, һуңынан күҙәнәк ҡалдыҡтарын һәм быяла монстрҙарын бөтөрөү өсөн центрифугалайҙар. Артабан супернатантты 17 000 г температурала 4°С температурала 1 сәғәт центрифугалайҙар. Пеллетты ТНЭ-ла йыуалар һәм 37°С температурала 1 сәғәт дауамында 0,2% дигиталис сапонинлы ТНЭ-ла 1 Е ПИ-ПЛК (Invitrogen) менән инкубациялайҙар. Ферменттар менән эшкәрткәндән һуң мембрана 17 000 г температурала 4°С температурала 1 сәғәт центрифугалау юлы менән сығарыла. Газ1-ГФП-ны иммунопреципитациялау өсөн супернатантты ГФП-Трап_А (ХромоТек) менән 4°С температурала төнө буйы инкубациялайҙар. SDS-PAGE ярҙамында айырылған таҙартылған Gas1-GFP Кумасси бриллиант күк төҫө менән буялған. Gas1-GFP буяу һыҙаты акведукты уратып алған һоро төҫтән ҡырҡып алынған, һуңынан йодацетамид менән алкиллаштырғандан һәм дитиотреитол менән редукцияланғандан һуң трипсин менән гель эсендә аш һеңдереүҙе башҡарғандар. Экстракт һәм ҡоро триптик пептидтар һәм пептидтар менән ГПИ-гликандар. Киптерелгән пептидты 20 мкл һыуҙа иретәләр. LC-ға бер өлөшөн (8мкл) индерәбеҙ. Пептидтарҙы айырым градиент шарттарында айырыу өсөн октадецилсилан (ОДС) колонкаһы (Develosil 300ODS-HG-5; эске диаметры 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айти префектураһы, Япония) ҡулланылған. Күсмә фаза булып А иреткесе (0,08% ҡырмыҫҡа кислотаһы) һәм В иреткесе (80% ацетонитрилдә 0,15% ҡырмыҫҡа кислотаһы) тора. Accela ВЭЖХ системаһы (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс штаты) ҡулланып, колонканы А иреткес менән 55 минут эсендә 50 мкл мин-1 тиҙлеге менән 5 минут элюциялайҙар, һуңынан В иреткесенең концентрацияһы 40%-ҡа тиклем арттырыла. , АҠШ). Элюат өҙлөкһөҙ ESI ион сығанағына индерелә, ә триптик пептидтар һәм GPI-гликандар менән пептидтар LTQ Orbitrap XL (гибрид һыҙыҡлы ион тоҙаҡ-орбитрап масс-спектрометры; Thermo Fisher Scientific) ярҙамында анализлана. МС ҡуйыуҙа капилляр сығанағының көсөргәнеше 4,5 кВ-ҡа ҡуйылған, ә тапшырыу капиллярының температураһы 300°С-та һаҡланған. Капилляр көсөргәнеш һәм линза лампаларының көсөргәнеше ярашлы рәүештә 15 В һәм 50 В тип ҡуйылған. MS мәғлүмәттәр ыңғай ион режимында алынған (60,000 асыҡлыҡ; масса теүәллеге 10 өлөшө миллион) масса диапазонында 300/м/з масса/заряд нисбәте (м/з) 3000 бәйле. бәрелеш индуцированный диссоциация (CID)].
МД моделләштереүҙәре GROMACS (52) программа тәьминәте һәм MARTINI 2 көс яланы (53-55) ярҙамында башҡарылған. Һуңынан CHARMM GUI мембрана төҙөүсеһе (56, 57) диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) һәм Cer C18 йәки DOPC һәм Cer C26 составындағы ике ҡатлам төҙөү өсөн ҡулланылған. Cer C26 топологияһы һәм координаталары DXCE-нан сфингозин ҡойроғонан өҫтәмә монстрҙарҙы сығарыу юлы менән алынған. Түбәндә һүрәтләнгән процесты ҡулланып, ике ҡатламды баланслаштырыу һәм уны эшләтеү, һуңынан системаның һуңғы координаталарын ҡулланып, Emp24 составында система төҙөү. Трансмембранный домен әсетке Emp24 (ҡалдыҡтар 173 193) α-спираль булараҡ төҙөлгән, визуаль МД (ВМД) инструмент молекуляр структураһы ҡулланып (58). Артабан, ҡапланған липидтарҙы алып ташлағандан һуң, аҡһымды эре гранулировать итеп, CHARMM GUI ярҙамында ике ҡатламға индерәләр. Һуңғы системала 1202 ДОПК һәм 302 Цер С26 йәки 1197 ДОПК һәм 295 Цер С18 һәм Эмп24 бар. Система 0,150М концентрацияһына тиклем ионлаштырыла. Ике ике ҡатламлы композиция өсөн дүрт бойондороҡһоҙ ҡабатлау эшләнгән.
Липид ике ҡатлам CHARMM GUI процесы ярҙамында баланслаштырыла, был 405 мең аҙымды минималь кимәлгә еткереүҙе һәм һуңынан баланслаштырыуҙы үҙ эсенә ала, унда позиция сикләүҙәре яйлап кәмей һәм бөтөрөлә, ә ваҡыт аҙымы 0,005 пс-тан 0,02 пс-ҡа тиклем арттырыла. Тигеҙләшкәндән һуң ул 0,02 пс ваҡыт аҙымы менән 6 мкс етештерә. Emp24 индергәндән һуң, шул уҡ CHARMM GUI процесын ҡулланып, системаны минималь кимәлгә еткерергә һәм баланслаштырырға, ә һуңынан етештереүҙә 8 с эшләй.
Бөтә системалар өсөн баланслаштырыу процесында баҫым Берендсен баростаты (59), ә етештереү процесында баҫым Парринелло-Рахман баростаты (60) менән идара ителә. Бөтә осраҡтарҙа ла уртаса баҫым 1 бар тәшкил итә һәм ярым изотроп баҫым бәйләү схемаһы ҡулланыла. Баланс һәм етештереү процесында тиҙлекте ҡабаттан калибровкалау менән термостат (61) аҡһым, липид һәм иреткес киҫәксәләренең температураһын ярашлы рәүештә парлаштырыу өсөн ҡулланыла. Бөтә операция барышында маҡсатлы температура 310К тәшкил итә. Бәйләнешһеҙ үҙ-ара тәьҫир итешеү 0,005 буфер толерантлығы менән Верле схемаһы ярҙамында парлаштырыу исемлеген генерациялау юлы менән иҫәпләнә. Кулон термины реакция ҡыры һәм 1,1 нм өҙөү арауығы ярҙамында иҫәпләнә. Вандер Ваалс терминында 1,1 нм өҙөү арауығы менән өҙөү схемаһы ҡулланыла, ә потенциаль дрейф өсөн Верле өҙөү схемаһы ҡулланыла (62).
ВМД ҡулланып, DOPC фосфат монстрҙары йәки керамид AM1 монстрҙары менән аҡһым араһындағы өҙөк тулҡын оҙонлоғо 0,7 нм тәшкил итә, аҡһым менән үҙ-ара тәьҫир итешеүсе липидтар һаны иҫәпләнә. Түбәндәге формула буйынса (63)-тәге кеүек кәмей-байытыу (ДЭ) факторын иҫәпләгеҙ: ДЭ факторы = (аҡһымдағы дөйөм липидтар күләме 0,7) аҡһымдағы 0,7 (дөйөм липидтарҙағы Cer күләме) .
Отчет ҡиммәте уртаса алынған, ә хата һыҙыҡтары дүрт бойондороҡһоҙ күсермәһе SE. Статистик әһәмиәте DE факторы t тест [(уртасаDE-фактор-1)/SE] ярҙамында иҫәпләнә. Бер ҡойроҡло бүлекте Р ҡиммәтен иҫәпләгеҙ.
GROMACS инструменты эҙҙең һуңғы 250 нс эсендә Emp24 булған системаның 2D ян тығыҙлығы картаһын иҫәпләү өсөн ҡулланылған. Керамидтың байытыу/төшөрөү картаһын алыу өсөн Cer тығыҙлығы картаһын Cer һәм DOPC картаһы суммаһына бүләләр, һуңынан организмдағы Cer концентрацияһына бүләләр. Шул уҡ төҫ картаһы шкалаһы ҡулланыла.
Был мәҡәлә өсөн өҫтәмә материалдарҙы ҡарағыҙ:
Был асыҡ рөхсәт мәҡәләһе Creative Commons атрибуция-коммерцияға ҡарамаған лицензия шарттары буйынса таратыла, был теләһә ниндәй сараларҙа ҡулланыу, таратыу һәм ҡабатлау мөмкинлеген бирә, әгәр ҙә һуңғы ҡулланыу коммерция файҙаһы өсөн түгел һәм премия булып тора, тип, төп эш дөрөҫ. Һылтанма.
Иҫкәрмә: Беҙ һеҙҙең электрон почта адресығыҙҙы бирергә генә һорайбыҙ, һеҙ биткә кәңәш иткән кеше белә, һеҙ уларҙы күрергә теләйем, электрон почта һәм был спам түгел. Беҙ бер ниндәй ҙә электрон почта адрестарын тотмаясаҡбыҙ.
Был һорау һеҙҙең ҡунаҡ булыуын тикшерергә һәм автоматик спам тапшырыуҙы булдырмау өсөн ҡулланыла.
София Родригес-Галлардо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Босо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро), Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D юғары асыҡлыҡтағы реаль ваҡытта төшөрөү һайлап алыу сығарыу урындарында аҡһымдарҙы сорттарға айырыу өсөн керамид сылбырының оҙонлоғоноң мөһимлеген аса.
София Родригес-Галлардо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Босо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро), Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D юғары асыҡлыҡтағы реаль ваҡытта төшөрөү һайлап алыу сығарыу урындарында аҡһымдарҙы сорттарға айырыу өсөн керамид сылбырының оҙонлоғоноң мөһимлеген аса.
©2020 Америка фәнде үҫтереүҙең ассоциацияһы. бөтә хоҡуҡтары һаҡлана. АААС — ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф һәм КАУНТЕР компанияларының партнеры. 2375-2548 ISSN.