Беҙ быға тиклем хәбәр итеүенсә, эсәктәрҙән алынған триптофан метаболиты индол-3-пропион кислотаһы (ИПА) ҡан һыуытҡысында бауыр фиброзы менән ауырығандарҙа түбәнерәк. Был тикшеренеүҙең беҙ тикшергән транскриптома һәм ДНК метилом һимергән бауырҙарҙа ҡан һыуытҡысында ИПА кимәленә бәйле, шулай уҡ роле ИПА индуцировать фенотипик инактивация бауыр йондоҙло күҙәнәктәр (HSCs) in vitro.
Тикшеренеүҙең 2-се типтағы шәкәр диабеты (Т2ДМ) булмаған 116 һимергән пациент (йәш 46,8 ± 9,3 йәш; ИМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) ҡатнашҡан, улар Куопио бариатрик хирургия үҙәгендә (КОБС) бариатрик операция үткәргән. Ҡан әйләнеше ИПА кимәле шыйыҡса хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) ярҙамында үлсәнә, бауыр транскриптомаһы анализы дөйөм РНК секвенированиеһы ярҙамында башҡарыла, ә ДНК метилләшеү анализы Infinium HumanMethylation450 BeadChip ярҙамында башҡарыла. In vitro тәжрибәләре өсөн кеше бауыры йондоҙло күҙәнәктәре (LX-2) ҡулланылған.
Ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле бауырҙа апоптоз, митофаг һәм оҙайлы ғүмер юлдарында ҡатнашҡан гендар экспрессияһы менән бәйле. АКТ серин/треонинкиназа 1 (АКТ1) гены бауыр транскрипты һәм ДНК метилләшеү профилдәрендә иң күп һәм доминант үҙ-ара тәьҫир итешеүсе ген була. IPA дауалау апоптозды тыуҙыра, митохондрия тын алыуын кәметә, күҙәнәк морфологияһын һәм митохондрия динамикаһын үҙгәртә, фиброз, апоптоз һәм LX-2 күҙәнәктәренең йәшәүен көйләүсе гендар экспрессияһын модуляциялай.
Был мәғлүмәттәрҙе бергә йыйып ҡарағанда, ИПА-ның потенциаль дауалау эффекты барлығын һәм апоптозды тыуҙыра алыуын һәм ГСК фенотипын әүҙем булмаған хәлгә күсереүен раҫлай, шуның менән ГСК-ның әүҙемләшеүенә һәм митохондрия алмашыныуына ҡамасаулап, бауыр фиброзын тормошҡа ашырыу мөмкинлеген киңәйтә.
Һимергәнлек һәм метаболизм синдромының таралыуы метаболизм менән бәйле майлы бауыр ауырыуҙары (MASLD) менән ауырыу осраҡтарының артыуы менән бәйле; сир дөйөм халыҡтың 25-30 процентына ҡағыла [1]. MASLD этиологияһының төп эҙемтәһе булып бауыр фиброзы тора, динамик процесс сүсле күҙәнәктән тыш матрицаның (ЭКМ) өҙлөкһөҙ тупланыуы менән айырылып тора [2]. Бауыр фиброзында ҡатнашҡан төп күҙәнәктәр булып бауыр йондоҙло күҙәнәктәре (HSCs) тора, улар дүрт билдәле фенотип күрһәтә: тыныс, әүҙемләшкән, әүҙемләшмәгән һәм ҡартайыу [3, 4]. 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып α-шыма мускул актинының (α-SMA) һәм I типтағы коллагендың (Col-I) экспрессияһын арттырыуы менән тыныс форманан пролифератив фибробласт кеүек күҙәнәктәргә трансдифференциациялау тора. Бауыр фиброзын кире ҡайтарыу ваҡытында әүҙемләшкән ГСК апоптоз йәки инактивация аша юҡ ителә. Был процестар фиброген гендарҙы һәм просурвивал гендарҙы модуляциялауҙы (мәҫәлән, NF-κB һәм PI3K/Akt сигнал юлдары) [7, 8], шулай уҡ митохондрия динамикаһында һәм функцияһында үҙгәрештәрҙе үҙ эсенә ала [9].
Ҡан һыуытҡысында триптофан метаболит индол-3-пропион кислотаһы (IPA), эсәктәрҙә етештерелгән, кеше метаболизм ауырыуҙары, шул иҫәптән MASLD [10-13] кәмеүе асыҡланған. IPA диетик клетчатка ҡулланыу менән бәйле, антиоксидант һәм ялҡынһыныуға ҡаршы эффекты менән билдәле, һәм диета-индуцированный алкоголь булмаған стеатогепатит (NASH) фенотипын кәметә in vivo һәм in vitro [11-14]. Ҡайһы бер дәлилдәр беҙҙең алдағы тикшеренеүҙән килә, был күрһәткәнсә, ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле бауыр фиброзы менән ауырығандарҙа һимергән пациенттарҙа бауыр фиброзы булмаған Куопио бариатрия хирургияһы тикшерелеүендә (KOBS) түбәнерәк булған. Бынан тыш, беҙ күрһәткәнсә, IPA дауалау гендар экспрессияһын кәметергә мөмкин, улар классик маркерҙары күҙәнәк адгезияһы, күҙәнәк миграцияһы һәм ҡан яһаусы штамм күҙәнәктәре активацияһы кеше бауыры йондоҙло күҙәнәк (LX-2) моделе һәм потенциаль гепатопротектор метаболит [15]. Әммә IPA-ның HSC апоптозын һәм митохондрия биоэнергетикаһын әүҙемләштереү юлы менән бауыр фиброзы регрессияһын нисек индуцирлауы асыҡланмаған.
Бында, беҙ күрһәтәбеҙ, ҡан һыуытҡысы IPA гендар экспрессияһы менән бәйле апоптоз байытылған, митофагия, һәм оҙайлы ғүмер юлдары бауырында һимергән, әммә 2 типтағы шәкәр диабеты (KOBS) айырым кешеләр. Бынан тыш, беҙ асыҡланыҡ, тип IPA клиренс һәм деградация индуцировать активлаштырылған ҡан яһаусы тыуым күҙәнәктәре (HSCs) аша инактивация юлы. Был һөҙөмтәләр ИПА өсөн яңы роль асыҡлай, уны бауыр фиброзы регрессияһына булышлыҡ итеү өсөн потенциаль дауалау маҡсатына әйләндерә.
KOBS когортаһында үткәрелгән алдағы тикшеренеүҙең күрһәтеүенсә, бауыр фиброзы менән ауырығандарҙа бауыр фиброзы булмаған пациенттар менән сағыштырғанда түбән әйләнештәге ИПА кимәле [15]. 2-се типтағы шәкәр диабеты потенциаль бутау эффектын сығарыу өсөн, беҙ 2-се типтағы шәкәр диабеты булмаған 116 һимергән пациенттарҙы йыйҙыҡ (уртаса йәш ± SD: 46,8 ± 9,3 йыл; ИМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (1-се таблица) популяциянан [the6y]. Ҡатнашыусылар барыһы ла яҙма рәүештә ризалыҡ бирҙе һәм тикшеренеүҙең протоколы Хельсинки декларацияһына ярашлы Төньяҡ Саво округы дауаханаһының этика комитеты тарафынан раҫланды (54/2005, 104/2008 һәм 27/2010).
Бауыр биопсияһы өлгөләре бариатрик хирургия ваҡытында алынған һәм тәжрибәле патологтар тарафынан алдан һүрәтләнгән критерийҙар буйынса гистологик баһаланған [17, 18]. Баһалау критерийҙары өҫтәмә таблица S1 дөйөмләштерелә һәм элек һүрәтләнгән [19].
Ураҙа тотҡан ҡан һыуытҡысы өлгөләре метаболомика анализы өсөн маҡсатлы булмаған шыйыҡса хроматографияһы-масс-спектрометрия (LC-MS) ярҙамында анализланды (n = 116). 1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Вальдбронн, Карлсруэ, Германия) ярҙамында өлгөләр анализланды, нисек һүрәтләнгән элек19. Изопропил спиртын (ИПА) асыҡлау һаҡлау ваҡытына һәм МС/МС спектрын таҙа стандарттар менән сағыштырыуға нигеҙләнгән. IPA сигнал интенсивлығы (пик майҙаны) бөтә артабанғы анализдарҙа ҡаралды [20].
2500 Illumina HiSeq ҡулланып, бөтә бауыр РНК-һының секвенированиеһы башҡарылған һәм мәғлүмәттәр алдан эшкәртелгән, нисек элек һүрәтләнгән [19, 21, 22]. 1957 йылда MitoMiner 4.0 базаһынан һайланған гендарҙы ҡулланып, митохондрия функцияһына/биогенезға йоғонто яһаған транскрипттарҙы маҡсатлы дифференциаль экспрессия анализы үткәрҙек [23]. Бауыр ДНК метилирование анализы үткәрелгән ҡулланыу Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, CA, АҠШ) ҡулланып, шул уҡ методология, нисек һүрәтләнгән элек [24, 25].
Кеше бауыры йондоҙло күҙәнәктәре (LX-2) профессор Стефано Ромео тарафынан рәхимлелек менән тәьмин ителгән һәм ДМЭМ/F12 мөхитендә үҫтерелгән һәм һаҡланған (Биовест, L0093-500, 1% Пен/Стреп; Һайлау өсөн эш дозаһы ИПА, LX-2 күҙәнәктәре менән эшкәртелгән төрлө концентрациялы ИПА (10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ; Сигма, 220027) DMEM/F12 мөхитендә 24 сәғәт. Бынан тыш, тикшерергә мөмкинлеге ИПА инактивациялау өсөн HSCs, LX-2 күҙәнәктәре менән бергә эшкәртелгән 5 нг/мл ТГФ-β1 (R&D системалары, 240-B-002/CF) һәм 1 мМ ИПА ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә 24 сәғәт. Тейешле транспорт саралары өсөн контроль, 4 нМ HCL составында 0.1% BSA ҡулланылған өсөн ТГФ-β1 дауалау һәм 0.05% ДМСО ҡулланылған өсөн IPA дауалау, һәм икеһе лә бергә ҡулланылған комбинациялы дауалау өсөн.
Апоптоз баһаланды ҡулланыу FITC аннексин V апоптоз асыҡлау комплекты менән 7-AAD (Biolegend, Сан-Диего, CA, АҠШ, Cat# 640922) етештереүсе күрһәтмәләре буйынса. Ҡыҫҡаһы, LX-2 (1 × 105 күҙәнәк/скважина) 12-скважина пластинкаларҙа төнө буйы үҫтерелгән, һуңынан бер нисә доза ИПА йәки ИПА һәм ТГФ-β1 менән эшкәртелгән. Икенсе көндө йөҙөүсе һәм йәбешкәк күҙәнәктәр йыйыла, трипсинлаштырыла, PBS менән йыуыла, аннексин V бәйләү буферында ресуспендировать ителә һәм FITC-аннексин V һәм 7-AAD менән 15 минут инкубациялана.
Тере күҙәнәктәрҙәге митохондриялар окисландырыусы эшмәкәрлек өсөн MitotrackerTM Ҡыҙыл CMXRos (МТР) (Термо Фишер фәнни, Карлсбад, Калифорния) ҡулланып буялған. МТР анализдары өсөн LX-2 күҙәнәктәре IPA һәм TGF-β1 менән тигеҙ тығыҙлыҡта инкубациялана. сәғәттән һуң, тере күҙәнәктәр трипсинлаштырылған, PBS менән йыуылған, ә һуңынан 100 мкМ МТР менән инкубацияланған ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә 37 °C 20 минут, нисек һүрәтләнгән элек [ 26 ]. Тере күҙәнәк морфологияһын анализлау өсөн күҙәнәктәрҙең ҙурлығы һәм цитоплазма ҡатмарлылығы ярашлы рәүештә алға таралыу (FSC) һәм ян таралыу (SSC) параметрҙары ярҙамында анализланған.
Бөтә мәғлүмәттәр (30 мең ваҡиға) NovoCyte Quanteon (Agilent) программаһы ярҙамында алынған һәм NovoExpress® 1.4.1 йәки FlowJo V.10 программа тәьминәте ярҙамында анализланған.
Кислород ҡулланыу тиҙлеге (OCR) һәм күҙәнәктән тыш кислоталылыҡ тиҙлеге (ECAR) реаль ваҡытта диңгеҙ аты күҙәнәктән тыш ағым анализаторы ярҙамында үлсәнә (Agilent Technologies, Санта-Клара, CA) етештереүсенең күрһәтмәләре буйынса диңгеҙ аты XF күҙәнәк мито стресс менән йыһазландырылған. Ҡыҫҡаһы, 2 × 104 LX-2 күҙәнәктәр/скважина XF96 күҙәнәк культураһы пластинкаһына сәселгән. Төнө буйы инкубацияланғандан һуң күҙәнәктәрҙе изопропанол (ИПА) һәм ТГФ-β1 (1-се өҫтәмә ысулдар) менән эшкәртәләр. Мәғлүмәттәрҙе анализлау Seahorse XF Wave программа тәьминәте ярҙамында башҡарылған, унда Seahorse XF күҙәнәк энергияһы фенотибы һынау отчеты генераторы инә. Бынан биоэнергетик һаулыҡ индексы (БХИ) иҫәпләнгән [27].
Дөйөм РНК кДНК-ға транскрипцияланған. Аныҡ ысулдар өсөн һылтанманы ҡарағыҙ [15]. Кеше 60S рибосомалы кислоталы аҡһым Р0 (RPLP0) һәм циклофилин А1 (PPIA) мРНК кимәле конститутив ген контроль булараҡ ҡулланылған. 6-сы про реаль ваҡытта ПЦР системаһы (Термо Фишер, Ландсмер, Нидерландтар) менән ҡулланылған TaqMan TM тиҙ алдынғы мастер-микс комплекты (ғәмәли биосистемалар) йәки Sensifast SYBR Lo-ROX комплекты (Биолин, БИО 94050) сағыштырмаса экспрессия ҡиммәте булды), һәм параметрҙары (ΔΔCt) һәм ∆∆Ct ысулы менән ҡулланыла. Праймерҙар тураһында ентекле мәғлүмәт S2 һәм S3 өҫтәмә таблицаларында бирелгән.
Ядро ДНК (ncDNA) һәм митохондрия ДНК (mtDNA) экстракцияланған DNeasy ҡан һәм туҡыма комплекты (Qiagen) ҡулланып, нисек һүрәтләнгән элек [28]. мтДНК-ның сағыштырмаса күләме һәр маҡсатлы мтДНК төбәгенең өс ядро ​​ДНК төбәгенең геометрик уртаса нисбәтен иҫәпләү юлы менән иҫәпләнгән (мтДНК/нсДНК), өҫтәмә ысулдарҙа ентекле 2. мтДНК һәм нсДНК өсөн праймерҙар тураһында мәғлүмәт өҫтәмә таблицала бирелгән S4.
Тере күҙәнәктәрҙе күҙәнәк-ара һәм күҙәнәк эсендәге митохондрия селтәрҙәрен күрһәтеү өсөн MitotrackerTM ҡыҙыл CMXRos (МТР) (Термо Фишер фәнни, Карлсбад, Калифорния) менән буяғандар. LX-2 күҙәнәктәре (1 × 104 күҙәнәк/скважина) быяла слайдтарҙа тейешле быяла төплө культура пластинкаларында (Ibidi GmbH, Martinsried, Германия) үҫтерелгән. сәғәттән һуң, тере LX-2 күҙәнәктәре менән инкубацияланған 100 мкМ МТР 20 минут 37 °C һәм күҙәнәк ядролары DAPI менән буялған (1 мкг/мл, Сигма-Ольдрих) нисек һүрәтләнгән элек [29]. Митохондрия селтәрҙәре визуализацияланған ҡулланыу Цайс Axio Observer инверсия микроскоп (Карл Цайс Microimaging GmbH, Йена, Германия) Цайс LSM 800 конфокаль модуле менән йыһазландырылған 37 °C дымлы атмосферала 5% CO2 менән 5% CO2 ҡулланыу .63je. Беҙ һәр өлгө тибы өсөн ун Z-сериялы һүрәт алдыҡ. Һәр Z-серияһында 30 өлөш бар, һәр береһенең ҡалынлығы 9,86 мкм. Һәр өлгө өсөн ун төрлө күренеш өлкәһендәге һүрәттәр ZEN 2009 программа тәьминәте ярҙамында алынған (Карл Цайс Microimaging GmbH, Йена, Германия), ә митохондрия морфологияһы анализы ImageJ программа тәьминәте ярҙамында башҡарылған (v1.54d) [30, 31] параметрҙары буйынса ентекле Metho.
Күҙәнәктәрҙе 0,1 М фосфат буферында 2% глутаральдегид менән нығыталар, унан һуң 1% осмий тетроксиды иретмәһе менән нығыталар (Sigma Aldrich, MO, USA), яйлап ацетон менән һыуһыҙландыралар (Merck, Дармштадт, Германия), ниһайәт, эпоксид смолаға һалалар. Ультранәҙек өлөштәр әҙерләнгән һәм 1% уранилацетат (Merck, Дармштадт, Германия) һәм 1% ҡурғаш цитраты (Merck, Дармштадт, Германия) менән буялған. Ультраструктур һүрәттәр JEM 2100F EXII тапшырыу электрон микроскобы (JEOL Ltd, Токио, Япония) ярҙамында 80 кВ тиҙләтеү көсөргәнешендә алынған.
сәғәт дауамында IPA менән эшкәртелгән LX-2 күҙәнәктәренең морфологияһы 50 тапҡыр ҙурайтыуҙа фазалы контраст микроскопия ярҙамында Цайс инверсиялы яҡтылыҡ микроскобы (Zeiss Axio Vert.A1 һәм AxioCam MRm, Йена, Германия) ярҙамында анализланған.
Клиник мәғлүмәттәр уртаса ± стандарт тайпылыш йәки медиана (квартилдәр араһындағы диапазон: IQR) тип күрһәтелгән. Өс тикшерелгән төркөм араһындағы айырманы сағыштырыу өсөн дисперсияның бер яҡлы анализы (өҙлөкһөҙ үҙгәртеүселәр) йәки χ2 тесты (категориялы үҙгәртеүселәр) ҡулланылған. Ялған ыңғай күрһәткес (FDR) күп тапҡыр тикшерелгән өсөн төҙәтеү өсөн ҡулланылған, ә FDR < 0,05 булған гендар статистик әһәмиәтле тип иҫәпләнгән. Спирман корреляция анализы ҡулланылған корреляция CpG ДНК метилирование менән IPA сигнал интенсивлығы, номиналь р ҡиммәттәре менән (р <0.05) хәбәр ителә.
268 транскрипт (номиналь р <0,01), 119 митохондрия менән бәйле транскрипттар (номиналь р <0,05), һәм 4350 әйләнештәге CpGs гендар йыйылмаһын анализлау ҡоралы (WebGestalt) ҡулланып башҡарылған. Ҡапланған гендарҙы табыу өсөн ирекле ҡулланылған Venny DB (2.1.0 версияһы) ҡоралы, ә аҡһым-аҡһым үҙ-ара тәьҫир итешеүен күрһәтеү өсөн StringDB (11.5 версияһы) ҡулланылған.
LX-2 тәжрибәһе өсөн өлгөләрҙе Д'Агостино-Пирсон тесты ярҙамында нормаль тип тикшергәндәр. Мәғлүмәттәр кәмендә өс биологик репликанан алынған һәм Бонферрони post hoc тесты менән бер яҡлы ANOVA үткәрелгән. 0,05-тән кәмерәк р-ҡиммәте статистик яҡтан әһәмиәтле тип иҫәпләнгән. Мәғлүмәттәр уртаса ± SD рәүешендә бирелгән, ә тәжрибәләр һаны һәр һүрәттә күрһәтелгән. Бөтә анализдар һәм графиктар Windows өсөн GraphPad Prism 8 статистик программа тәьминәте (GraphPad Software Inc., 8.4.3 версияһы, Сан-Диего, АҠШ) ярҙамында башҡарылған.
Беренсенән, беҙ ҡан һыуытҡысында ИПА кимәленең бауыр, бөтә тән һәм митохондрия транскрипттары менән бәйләнешен тикшерҙек. Дөйөм транскрипт профилендә ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле менән бәйле иң көслө ген MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; митоген-активлаштырылған протеинкиназа-активлаштырылған протеинкиназа 3); митохондриялар менән бәйле транскрипт профилендә иң көслө бәйле ген AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серин/треонинкиназа 1) (Өҫтәмә файл 1 һәм Өҫтәмә файл 2) була.
Һуңынан беҙ глобаль транскрипттарҙы (n = 268; p <0,01) һәм митохондрия менән бәйле транскрипттарҙы (n = 119; p <0,05) анализланыҡ, ахыр сиктә апоптозды иң әһәмиәтле канон юл тип билдәләнек (p = 0,0089). Митохондрия транскрипттары өсөн ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле менән бәйле, беҙ апоптозға йүнәлтелгән (ФДР = 0.00001), митофагия (ФДР = 0.00029), һәм ТНФ сигнал юлдары (ФДР = 0.000006) (һүрәт 1А, таблица 2, һәм өҫтәмә һүрәттәр ВВ 1).
Ҡапланған анализ глобаль, митохондрия менән бәйле транскрипттар, һәм ДНК метилирование кеше бауырында ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле менән бәйле. А күрһәтә 268 глобаль транскрипттар, 119 митохондрия-ассоциированный транскрипттар, һәм ДНК метилированный транскрипттар, улар картаға 3092 CpG сайттар менән бәйле ҡан һыуытҡысы IPA кимәлдәре (р ҡиммәттәре < 0.01 глобаль транскрипттар һәм ДНК метилированный өсөн, һәм р ҡиммәттәре өсөн mitrich0). Төп ҡапланған транскрипттар уртаһында күрһәтелгән (AKT1 һәм YKT6). гендар үҙ-ара тәьҫир итешеү картаһы менән иң юғары үҙ-ара тәьҫир итешеү балл (0,900) башҡа гендар менән төҙөлгән 56 ҡапланған гендар (ҡара һыҙыҡ төбәге), улар һиҙелерлек ҡан һыуытҡысында IPA кимәле менән бәйле булған онлайн-инструмент StringDB ҡулланып. Йәшел: гендар картаһына ген онтологияһы (GO) күҙәнәк компоненты: митохондриялар (GO:0005739). AKT1 — мәғлүмәттәргә нигеҙләнгән башҡа аҡһымдар менән үҙ-ара тәьҫир итешеү өсөн иң юғары балл (0,900) аҡһым (текст майнинг, тәжрибә, мәғлүмәт базалары һәм коэкспрессия нигеҙендә). Селтәр төйөндәре аҡһымдарҙы, ә ситтәре аҡһымдар араһындағы бәйләнештәрҙе күрһәтә.
Эсәк микробиотаһы метаболиттары ДНК метилләшеүе аша эпигенетик составты көйләй алғанлыҡтан [32], беҙ ҡан һыуытҡысында ИПА кимәленең бауыр ДНК метилләшеүе менән бәйле булыуын тикшерҙек. Беҙ асыҡланыҡ, тип ике төп метилирование сайттары менән бәйле ҡан һыуытҡысы IPA кимәле янында пролин-серин-бай төбәк 3 (C19orf55) һәм йылылыҡ шок аҡһым ғаиләһе В (бәләкәй) ағзаһы 6 (HSPB6) (Өҫтәмә файл 3). ДНК метилирование 4350 CpG (р <0.01) ҡан һыуытҡысында IPA кимәле менән корреляцияланған һәм оҙайлы ғүмер көйләү юлдары менән байытылған (р = 0.006) (һүрәт 1А, таблица 2, һәм өҫтәмә һүрәт 1С).
Ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле, глобаль транскрипттар, митохондрия менән бәйле транскрипттар һәм кеше бауырында ДНК метилләшеүе араһындағы бәйләнештәрҙең нигеҙендә ятҡан биологик механизмдарҙы аңлау өсөн беҙ алдағы юл анализында билдәләнгән гендарҙы ҡаплау анализы үткәрҙек (1А һүрәте). Һөҙөмтәләр юл байытыу анализы 56 ҡапланған гендар (эсендә ҡара һыҙыҡ һүрәттә 1А) күрһәткәнсә, апоптоз юлы (р = 0,00029) өс анализ өсөн дөйөм ике гендарҙы айырып күрһәтте: АКТ1 һәм YKTn (YKT6 v-SNARE Figuren гомолог һәм Figuren 2 ). 1А). Ҡыҙыҡ, беҙ асыҡланыҡ, тип АКТ1 (cg19831386) һәм YKT6 (cg24161647) ыңғай корреляция менән ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле (Өҫтәмә файл 3). Ген продукттары араһындағы потенциаль аҡһым үҙ-ара тәьҫир итешеүен билдәләү өсөн беҙ 56 ҡапланған гендар араһында иң юғары дөйөм төбәк баһаһы (0,900) менән 13 генды һайланыҡ һәм үҙ-ара тәьҫир итешеү картаһын төҙөнөк. Ышаныс кимәле буйынса (маргиналь ышаныс) иң юғары балл (0,900) менән AKT1 гены өҫтә була (1-се һүрәт В).
Юл анализына нигеҙләнеп, беҙ апоптоздың төп юл булыуын асыҡланыҡ, шуға күрә беҙ ИПА дауалауының in vitro HSC-лар апоптозына йоғонто яһауын тикшерҙек. Беҙ быға тиклем күрһәткән, тип төрлө дозаларҙа IPA (10 мкМ, 100 мкМ, һәм 1 мМ) LX-2 күҙәнәктәре өсөн токсик булмаған [15]. Был тикшеренеүҙең күрһәтеүенсә, 10 мкМ һәм 100 мкМ ИПА менән дауалау йәшәүгә һәләтле һәм некротик күҙәнәктәр һанын арттыра. Әммә контроль төркөм менән сағыштырғанда, күҙәнәктәрҙең йәшәүсәнлеге 1 мМ ИПА концентрацияһында кәмей, ә күҙәнәктәрҙең некрозы тиҙлеге үҙгәрешһеҙ ҡала (2-се һүрәт А, В). Артабан, оптималь концентрацияһын табыу өсөн индуцировать апоптоз LX-2 күҙәнәктәрендә, беҙ 10 мкМ, 100 мкМ, һәм 1 мМ ИПА 24 сәғәт тикшерҙе (һүрәт 2А-Е һәм өҫтәмә һүрәт 3А-В). Ҡыҙыҡ, ИПА 10 мкМ һәм 100 мкМ кәметкән апоптоз тиҙлеге (%), шулай ҙа, ИПА 1 мМ һуң апоптоз һәм апоптоз тиҙлеген арттырыу (%) контроль менән сағыштырғанда һәм шуға күрә артабанғы тәжрибәләр өсөн һайланған (һүрәттәр 2А–D).
ИПА LX-2 күҙәнәктәренең апоптозын индуцирлай. Аннексин V һәм 7-AAD икеләтә буяу ысулы апоптоз тиҙлеген һәм күҙәнәк морфологияһын ағым цитометрияһы ярҙамында һанлаштырыу өсөн ҡулланылған. БА күҙәнәктәре 10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ ИПА менән 24 сәғәт йәки F–H ТГФ-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ ИПА менән ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә 24 сәғәт инкубациялана. Я: тере күҙәнәктәр (V ҡушымта -/ 7ААД-); В: некротик күҙәнәктәр (V ҡушымта -/ 7ААД+); С, Ф: иртә (V ҡушымта +/ 7ААД-); D, G: һуң (V+/7ААД.+ ҡушымтаһы); Е, Н: апоптоз тиҙлегендә дөйөм иртә һәм һуңғы апоптоз күҙәнәктәренең проценты (%). Мәғлүмәттәр уртаса ± SD, n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә тип бирелә. Статистик сағыштырыуҙар Бонферрони post hoc тесты менән бер яҡлы ANOVA ҡулланып башҡарылған. *р <0,05; ****р < 0,0001
нг/мл ТГФ-β1 классик маркер гендарының экспрессияһын арттырыу юлы менән HSC активацияһын индуцировать итә ала [15]. LX-2 күҙәнәктәре 5 нг/мл ТГФ-β1 һәм 1 мМ ИПА менән бергә эшкәртелгән (һүрәт. 2Е-Н). ТГФ-β1 дауалау үҙгәртмәне апоптоз тиҙлеге, шулай ҙа, IPA берлектә дауалау һуң апоптоз һәм апоптоз тиҙлеген арттырҙы (%) ТГФ-β1 дауалау менән сағыштырғанда (һүрәт. 2Е–Н). Был һөҙөмтәләр 1 мМ ИПА-ның LX-2 күҙәнәктәрендә ТГФ-β1 индукцияһынан тыш апоптозға булышлыҡ итә алыуын күрһәтә.
Беҙ артабан тикшерҙек эффекты IPA митохондрия тын алыу LX-2 күҙәнәктәрендә. Һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, 1 мМ ИПА кислород ҡулланыу тиҙлеген (ОКР) параметрҙарын кәметкән: митохондрияһыҙ тын алыу, базаль һәм максималь тын алыу, протондар ағыуы һәм АТФ етештереү контроль төркөм менән сағыштырғанда (3А, В һүрәте), шул уҡ ваҡытта биоэнергетик һаулыҡ индексы (БХИ) үҙгәрмәгән.
ИПА LX-2 күҙәнәктәрендә митохондрия тын алыуын кәметә. Митохондрия тын алыу ҡойроғо (OCR) митохондрия тын алыу параметрҙары (митохондрия булмаған тын алыу, базаль тын алыу, максималь тын алыу, протондар ағыуы, АТФ генерацияһы, SRC һәм BHI) булараҡ бирелә. А һәм В күҙәнәктәрен ярашлы рәүештә 10 мкМ, 100 мкМ һәм 1 мМ ИПА менән 24 сәғәт инкубациялайҙар. С һәм D күҙәнәктәре ТГФ-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ ИПА менән 24 сәғәт дауамында ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә инкубациялана. Бөтә үлсәүҙәр ҙә CyQuant комплекты ярҙамында ДНК составына нормалаштырылған. BHI: биоэнергетик һаулыҡ индексы; СРК: тын алыу резервы ҡөҙрәте; OCR: кислород ҡулланыу тиҙлеге. Мәғлүмәттәр уртаса ± стандарт тайпылыш (SD), n = 5 бойондороҡһоҙ тәжрибә рәүешендә бирелә. Статистик сағыштырыуҙар бер яҡлы ANOVA һәм Бонферрони post hoc тесты ҡулланып башҡарылған. *р <0,05; **р <0,01; һәм ***р <0,001
ИПА-ның ТГФ-β1-активлаштырылған LX-2 күҙәнәктәренең биоэнергетик профиленә йоғонтоһон ентеклерәк аңлау өсөн, беҙ митохондрияның окислывающий фосфорилләшеүен анализланыҡ OCR (һүрәт. 3С,D). Һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, ТГФ-β1 дауалау кәметергә мөмкин максималь тын алыу, тын алыу резервы ҡәҙере (SRC) һәм BHI контроль төркөмө менән сағыштырғанда (һүрәт. 3С,D). Бынан тыш, комбинациялы дауалау базаль тын алыуҙы кәметә, протондар ағыуы һәм АТФ етештереү, әммә SRC һәм BHI һиҙелерлек юғары булған, улар менән дауаланған ТГФ-β1 (һүрәт. 3С,D).
Беҙ шулай уҡ башҡарҙы “Күҙәнәк энергияһы фенотип һынау” тәьмин итеү Seahorse программа тәьминәте (Өҫтәмә һүрәт. 4А–D). Өҫтәмә һүрәттә күрһәтелгәнсә. 3В, икеһе лә OCR һәм ECAR метаболизм потенциалдары кәмегән һуң ТГФ-β1 дауалау, шулай ҙа, бер ниндәй ҙә айырма күҙәтелмәгән комбинация һәм IPA дауалау төркөмдәре менән сағыштырғанда, контроль төркөмө. Бынан тыш, базаль һәм стресс кимәле OCR кәмегән һуң комбинация һәм IPA дауалау контроль төркөмө менән сағыштырғанда (өҫтәмә һүрәт. 4С). Ҡыҙыҡ, ошондай уҡ ҡалып менән күҙәтелгән комбинациялы терапия, унда бер ниндәй ҙә үҙгәрештәр базаль һәм стресс кимәлендә ECAR күҙәтелгән менән сағыштырғанда ТГФ-β1 дауалау (Өҫтәмә һүрәт. 4С). ГСК-ла митохондрияларҙағы окисландырыусы фосфорилләшеүҙең кәмеүе һәм комбинациялы дауалау ысулының ТГФ-β1 дауалауынан һуң СКР һәм БХИ-ны тергеҙеү мөмкинлеге метаболизм потенциалын үҙгәртмәй (ОКР һәм ЭКАР). Был һөҙөмтәләрҙе бергә йыйып ҡарағанда, ИПА-ның ГСК-ла биоэнергетиканы кәметергә мөмкинлеген күрһәтә, был ИПА-ның түбәнге энергетик профилен индуцировать итеүе мөмкин тип фаразлай, был ХСК-ның фенотипын инактивацияға табан күсерә (өҫтәмә һүрәт 4D).
ИПА-ның митохондрия динамикаһына йоғонтоһо өс үлсәмле митохондрия морфологияһы һәм селтәр бәйләнештәрен миҡдарлаштырыу, шулай уҡ МТР буяу ҡулланып тикшерелде (4-се һүрәт һәм өҫтәмә һүрәт 5). 4-се һүрәттә күрһәтелгәнсә, контроль төркөм менән сағыштырғанда, ТГФ-β1 дауалау уртаса өҫкө майҙанды, тармаҡ һанын, тармаҡтың дөйөм оҙонлоғон һәм тармаҡ тоташыу һанын кәметкән (4-се һүрәт А һәм В) һәм митохондриялар өлөшөн сферик морфологиянан уртаса морфологияға тиклем үҙгәрткән (4-се һүрәт С). Тик ИПА менән дауалау уртаса митохондрия күләмен кәметкән һәм контроль төркөм менән сағыштырғанда митохондриялар өлөшөн сферик морфологиянан уртаса морфологияға үҙгәрткән (4-се һүрәт А). Ҡаршылыҡлы, сфериклыҡ, уртаса тармаҡ оҙонлоғо, һәм митохондрия эшмәкәрлеге баһаланған митохондрия мембранаһы потенциалына бәйле МТР (һүрәт 4А һәм Е) үҙгәрешһеҙ ҡалды һәм был параметрҙар төркөмдәр араһында айырылмай. Был һөҙөмтәләрҙе бергә йыйып ҡарағанда, ТГФ-β1 һәм ИПА дауалау митохондрия формаһын һәм күләмен, шулай уҡ тере LX-2 күҙәнәктәрендә селтәр ҡатмарлылығын модуляциялай кеүек күренә.
IPA LX-2 күҙәнәктәрендә митохондрия динамикаһын һәм митохондрия ДНК-һының күплеген үҙгәртә. А. Вәкиллекле конфокаль һүрәттәр тере LX-2 күҙәнәктәре менән инкубировать ТГФ-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ ИПА 24 сәғәт ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә күрһәтеү митохондрия селтәрҙәре менән буялған Mitotracker TM Ҡыҙыл CMXRos һәм ядролар менән буялған күк DAPI. Бөтә мәғлүмәттәрҙә бер төркөмдә кәмендә 15 һүрәт булған. Беҙ һәр өлгө тибы өсөн 10 Z-стек һүрәттәрен алдыҡ. Һәр Z-күсәре эҙмә-эҙлеклелегендә 30 ҡырҡылған, һәр береһенең ҡалынлығы 9,86 мкм булған. Масштаб: 10 мкм. Б. Һүрәткә адаптив сик ҡуйыу юлы менән билдәләнгән вәкиллекле объекттар (митохондриялар ғына). Һәр төркөмдәге бөтә күҙәнәктәр өсөн митохондрия морфологик селтәр бәйләнештәрен миҡдар анализы һәм сағыштырыу үткәрелгән. В. Митохондрия форма нисбәттәренең йышлығы. 0-ға яҡын ҡиммәттәр сферик формаларҙы, ә 1-гә яҡын ҡиммәттәр еп формаларын күрһәтә. D Митохондрия ДНК (мтДНК) составы материалдар һәм ысулдарҙа һүрәтләнгәнсә билдәләнде. E Mitotracker TM Ҡыҙыл CMXRos анализ ағым цитометрияһы ярҙамында башҡарылған (30,000 ваҡиға) материалдар һәм ысулдарҙа һүрәтләнгәнсә. Мәғлүмәттәр уртаса ± SD, n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә рәүешендә бирелә. Статистик сағыштырыуҙар бер яҡлы ANOVA һәм Бонферрони post hoc тесты ҡулланып башҡарылған. *р <0,05; **р <0,01; ***р < 0,001; ****р < 0,0001
Һуңынан беҙ LX-2 күҙәнәктәрендәге мтДНК составын митохондрия һаны күрһәткесе булараҡ анализланыҡ. Контроль төркөм менән сағыштырғанда, мтДНК содержаниеһы ТГФ-β1-эшкәртелгән төркөмдә арттырылған (һүрәт 4D). ТГФ-β1-эшкәртелгән төркөм менән сағыштырғанда, мтДНК содержаниеһы кәмегән комбинациялы дауалау төркөмө (һүрәт 4D), тип фаразлай IPA мтДНК содержаниеһы һәм, бәлки, митохондрия һаны, шулай уҡ митохондрия тын алыу кәметергә мөмкин (һүрәт 3С). Өҫтәүенә, IPA комбинациялы дауалауҙа мтДНК составын кәметергә кеүек тойолдо, әммә МТР-медиациялы митохондрия эшмәкәрлегенә йоғонто яһаманы (4А–С һүрәттәре).
Беҙ тикшергән ассоциацияһы менән IPA мРНК кимәлдәре гендар менән бәйле фиброз, апоптоз, йәшәү, һәм митохондрия динамикаһы LX-2 күҙәнәктәрендә (һүрәт 5А-D). Контроль төркөм менән сағыштырғанда, ТГФ-β1-эшкәртелгән төркөм гендар экспрессияһын арттырыу күрһәтте, мәҫәлән, коллаген тип I α2 сылбыр (COL1A2), α-тигеҙ мускул актин (αSMA), матрица металлопротеиназа 2 (ММР2), туҡыма ингибиторы металлопротеиназа (RPD1), andTI11. фиброз һәм активлашыу көсәйә. Бынан тыш, контроль төркөм менән сағыштырғанда, ТГФ-β1 дауалау мРНК кимәлен кәметкән ядро ​​прегнан Х рецепторы (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, ингибиторы В-күҙәнәк α, көсәйткес ядро ​​факторы κ ген кинатор яҡтылыҡ пептид (NFκhiB1A), ядро ​​. β (ИКБКБ) (5А–Д һүрәте). ТГФ-β1 менән сағыштырғанда, ТГФ-β1 һәм ИПА менән бергә дауалау COL1A2 һәм ММР2 экспрессияһын кәметкән, әммә мРНК кимәлен арттырған PXR, TIMP1, В-клеткалы лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκBB1-ИК. ИПА дауалау һиҙелерлек кәмегән экспрессияһы ММР2, Bcl-2-ассоциированный аҡһым Х (БАХ), АКТ1, оптик атрофия аҡһым 1 (ОПА1), һәм митохондрия синтез аҡһым 2 (МФН2), шул уҡ ваҡытта экспрессияһы CASP8, NFκB1A, NFκBB1B төркөмө менән сағыштырғанда, һәм контролдә тотолған. Әммә каспаза-3 (CASP3), апоптоз пептидазаһын әүҙемләштереүсе фактор 1 (APAF1), митохондрияның 1-се синтез аҡһымы (MFN1) һәм 1-се бүленеш аҡһымы (FIS1) экспрессияһында айырма табылмаған. Йыйынтыҡта был һөҙөмтәләр ИПА-ны дауалау фиброз, апоптоз, йәшәү һәм митохондрия динамикаһы менән бәйле гендар экспрессияһын модуляциялай тип фаразлай. Беҙҙең мәғлүмәттәр IPA дауалау LX-2 күҙәнәктәрендә фиброзды кәметә тип фаразлай; шул уҡ ваҡытта фенотипты инактивацияға күсереп, йәшәүҙе стимуллаштыра.
IPA LX-2 күҙәнәктәрендә фибробласт, апоптоз, йәшәүсәнлек һәм митохондрия динамикаһы гендарының экспрессияһын модуляциялай. Гистограммалар мРНК экспрессияһын күрһәтә, эндоген контролгә ҡарата (RPLP0 йәки PPIA) һуң LX-2 күҙәнәктәре менән индуцированный TGF-β1 һәм IPA ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә 24 сәғәт. А фибробластарҙы, В апоптоз күҙәнәктәрен, С иҫән ҡалған күҙәнәктәрҙе, Д митохондрия динамикаһы гендарының экспрессияһын күрһәтә. Мәғлүмәттәр уртаса ± стандарт тайпылыш (SD), n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә рәүешендә бирелә. Статистик сағыштырыуҙар бер яҡлы ANOVA һәм Бонферрони post hoc тесты ҡулланып башҡарылған. *р <0,05; **р <0,01; ***р < 0,001; ****р < 0,0001
Һуңынан, күҙәнәк күләме үҙгәрештәре (FSC-H) һәм цитоплазма ҡатмарлылығы (SSC-H) ағым цитометрияһы ярҙамында баһаланды (һүрәт 6А,В), һәм күҙәнәк морфологияһында үҙгәрештәр ИПА дауалауҙан һуң тапшырыу электрон микроскопияһы (ТЭМ) һәм фаза контраст микроскопияһы ярҙамында баһаланды (Өҫтәмә һүрәт-В). Көтөлгәнсә, күҙәнәктәр ТГФ-β1-эшкәртелгән төркөмдә контроль төркөм менән сағыштырғанда күләме артты (һүрәт 6А,В), классик киңәйтеү күрһәтеү ҡырыҫ эндоплазматик селтәр (ЭР *) һәм фаголизосомалар (Р), ҡан яһаусы тамыр күҙәнәк күрһәтә (HSC) активация (Өҫтәмә һүрәт 6А). Әммә, ТГФ-β1-эшкәртелгән төркөм менән сағыштырғанда, күҙәнәк күләме, цитоплазма ҡатмарлылығы (һүрәт. 6А,В), һәм ER * содержаниеһы кәмегән ТГФ-β1 һәм ИПА комбинациялы дауалау төркөмө (өҫтәмә һүрәт. 6А). Бынан тыш, IPA дауалау күҙәнәк күләмен кәметкән, цитоплазма ҡатмарлылығы (һүрәттәр. 6А,В), Р һәм ER * содержаниеһы (өҫтәмә һүрәт. 6А) контроль төркөмө менән сағыштырғанда. Бынан тыш, апоптоз күҙәнәктәре составы 24 сәғәттән һуң ИПА дауалау контроль төркөмө менән сағыштырғанда артты (аҡ уҡтар, өҫтәмә һүрәт. 6В). Йыйынтыҡта был һөҙөмтәләр 1 мМ ИПА-ның ГСК апоптозын стимуллаштырыуы һәм ТГФ-β1 индуцированный күҙәнәк морфологик параметрҙарындағы үҙгәрештәрҙе кире ҡайтарыуы, шуның менән күҙәнәк күләмен һәм ҡатмарлылығын көйләүе тураһында һөйләй, был ГСК-ның инактивацияһы менән бәйле булыуы мөмкин.
IPA LX-2 күҙәнәктәрендә күҙәнәктәрҙең ҙурлығын һәм цитоплазма ҡатмарлылығын үҙгәртә. Ағым цитометрияһы анализының репрезентатив һүрәттәре. Анализда LX-2 күҙәнәктәре өсөн махсус ҡапҡа стратегияһы ҡулланылған: күҙәнәк популяцияһын билдәләү өсөн SSC-A/FSC-A, дублеттарҙы асыҡлау өсөн FSC-H/FSC-A, күҙәнәктәрҙең ҙурлығын һәм ҡатмарлылығын анализлау өсөн SSC-H/FSC-H. Күҙәнәктәрҙе ТГФ-β1 (5 нг/мл) һәм 1 мМ ИПА менән ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә 24 сәғәт инкубациялайҙар. LX-2 күҙәнәктәре күҙәнәк күләме һәм цитоплазмалы анализ өсөн аҫҡы һул квадранты (SSC-H-/FSC-H-), өҫкө һул квадранты (SSC-H+/FSC-H-), уң аҫҡы квадранты (SSC-H-/FSC-H+) һәм өҫкө уң квадранты (SSC-H+/FSC-H+) бүленә. Б. Күҙәнәк морфологияһы FSC-H (алға таралыу, күҙәнәк ҙурлығы) һәм SSC-H (ян таралыу, цитоплазма ҡатмарлылығы) (30 000 ваҡиға) ҡулланып ағым цитометрияһы ярҙамында анализланған. Мәғлүмәттәр уртаса ± SD, n = 3 бойондороҡһоҙ тәжрибә рәүешендә бирелә. Статистик сағыштырыуҙар бер яҡлы ANOVA һәм Бонферрони post hoc тесты ҡулланып башҡарылған. *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001 һәм ****р <0,0001
IPA кеүек эсәк метаболиттары тикшеренеүҙең ҡыҙыу темаһына әүерелде, эсәк микробиотаһында яңы маҡсаттар табылыуы ихтимал тип фаразлай. Шуға күрә ҡыҙыҡлы, тип IPA, метаболит, беҙ кешеләрҙә бауыр фиброзы менән бәйле [15], хайуандар моделдәрендә потенциаль анти-фиброз берләшмәһе булып күрһәтелгән [13, 14]. Бында беҙ тәүге тапҡыр ҡан һыуытҡысы ИПА һәм глобаль бауыр транскриптомикаһы һәм ДНК метилләшеүе араһындағы бәйләнеште күрһәтәбеҙ. Беҙҙең тикшеренеүҙең тағы бер яңылығы шунда: беҙ апоптоз менән дауалау IPA үҙ-ара тәьҫир итешеүен күрһәттек, күҙәнәк морфологияһы, митохондрия биоэнергетикаһы һәм LX-2 күҙәнәктәрендә динамика, түбән энергия спектрын күрһәтә, был HSC фенотипын инактивацияға табан күсерә, IPA потенциаль li fibrosis өсөн кандидат булып тора.
Беҙ асыҡланыҡ, апоптоз, митофагия һәм оҙайлы ғүмер иң мөһим канон юлдары булып тора, бауыр гендары менән байытылған әйләнештәге ҡан һыуытҡысы ИПА менән бәйле. Митохондрия сифатын контролдә тотоу системаһын боҙоу (MQC) митохондрия дисфункцияһына килтерергә мөмкин, митофагия һәм апоптоз, шул рәүешле MASLD барлыҡҡа килгәненә булышлыҡ итә [33, 34]. Шуға күрә беҙ фаразлай алабыҙ, ИПА күҙәнәк динамикаһын һәм митохондрия бөтөнлөгөн һаҡлауҙа апоптоз, митофагия һәм бауырҙа оҙайлы ғүмер аша ҡатнашырға мөмкин. Беҙҙең мәғлүмәттәр күрһәтеүенсә, ике ген өс анализ буйынса дөйөм булған: YKT6 һәм AKT1. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: YKT6 күҙәнәк мембранаһының берләшеү процесында ҡатнашҡан SNARE аҡһымы булып тора. Ул аутофагия һәм митофагияла роль уйнай, STX17 һәм SNAP29 менән аутофагосомаларҙа инициация комплексы барлыҡҡа килтерә, шуның менән аутофагосомалар һәм лизосомаларҙы берләштереүгә булышлыҡ итә [35]. Бынан тыш, YKT6 функцияһын юғалтыу һөҙөмтәһендә митофагия боҙола [36], шул уҡ ваҡытта YKT6 upregulation гепатоцеллюляр карцинома прогрессивлығы менән бәйле (HCC), күҙәнәктәрҙең йәшәү оҙайлығын арттырыу күрһәтеү [37]. Икенсе яҡтан, AKT1 иң мөһим үҙ-ара ген һәм бауыр ауырыуҙары мөһим роль уйнай, шул иҫәптән PI3K/AKT сигнал юл, күҙәнәк циклы, күҙәнәк миграцияһы, пролиферация, фокуслы адгезия, митохондрия функцияһы, һәм коллаген секрецияһы [38-40]. PI3K/AKT сигнал юлының әүҙемләштерелгән ҡан яһаусы тыуым күҙәнәктәрен әүҙемләштереүе мөмкин (HSCs), улар күҙәнәктәр етештереү өсөн яуаплы внеклеточный матрица (ECM), һәм уның дисрегуляцияһы бауыр фиброзының барлыҡҡа килгәненә һәм прогрессив үҫешенә булышлыҡ итә ала [40]. Бынан тыш, АКТ төп күҙәнәк йәшәү факторҙарының береһе булып тора, тип тормошҡа ашырыу р53-зависимый күҙәнәк апоптоз, һәм АКТ активацияһы менән бәйле булыуы мөмкин тормошҡа ашырыу бауыр күҙәнәктәре апоптоз [41, 42]. Алынған һөҙөмтәләр шуны күрһәтә: ИПА бауыр митохондриялары менән бәйле апоптозда ҡатнашырға мөмкин, гепатоциттар апоптозға инеү йәки йәшәү араһындағы ҡарарға йоғонто яһай. Был эффекттарҙы АКТ һәм/йәки YKT6 кандидат гендары көйләй ала, улар бауыр гомеостазы өсөн үтә мөһим.
Беҙҙең һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, 1 мМ ИПА индуцированный апоптоз һәм кәмегән митохондрия тын алыу LX-2 күҙәнәктәрендә бойондороҡһоҙ ТГФ-β1 дауалау. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: апоптоз фиброзды хәл итеү һәм ҡан яһаусы тамыр күҙәнәктәрен (HSC) әүҙемләштереү өсөн төп юл булып тора, шулай уҡ бауыр фиброзының кире физиологик яуап биреүҙең төп ваҡиғаһы булып тора [4, 43]. Өҫтәүенә, комбинациялы дауалауҙан һуң LX-2 күҙәнәктәрендә БХИ-ны тергеҙеү митохондрия биоэнергетикаһын көйләүҙә ИПА-ның потенциаль роле тураһында яңы төшөнсәләр бирҙе. Ял һәм әүҙем булмаған шарттарҙа ҡан яһаусы күҙәнәктәр, ғәҙәттә, АТФ етештереү өсөн митохондрияның окисланыу фосфорилләшеүен файҙалана һәм түбән метаболизм активлығына эйә. Икенсе яҡтан, HSC активацияһы митохондрия тын алыу һәм биосинтез көсәйтә, энергия талаптарын компенсациялау өсөн гликолит хәленә инеү [44]. ИПА-ның матдәләр алмашыныуы потенциалына һәм ЭКАР-ға йоғонто яһамауы гликолит юлының өҫтөнлөклө өлөшө әҙерәк булыуын күрһәтә. Шулай уҡ, икенсе тикшеренеүҙең күрһәтеүенсә, 1 мМ ИПА кардиомиоциттарҙа, кеше гепатоцит күҙәнәк һыҙығында (Huh7) һәм кеше киндер венаһы эндотелий күҙәнәктәрендә (HUVEC) митохондрия тын алыу сылбырының эшмәкәрлеген модуляциялай ала; Әммә кардиомиоциттарҙа гликолизға ИПА-ның бер ниндәй ҙә йоғонтоһо табылмаған, был ИПА-ның башҡа күҙәнәк төрҙәренең биоэнергетикаһына йоғонто яһауы мөмкинлеген күрһәтә [45]. мМ ИПА еңел химик разъединитель булып эшләй ала, сөнки ул фиброген ген экспрессияһын, күҙәнәк морфологияһын һәм митохондрия биоэнергетикаһын мтДНК күләмен үҙгәртмәйенсә һиҙелерлек кәметергә мөмкин тип фаразлайбыҙ [46]. Митохондрияларҙы өҙөүселәр культура индуцированный фиброз һәм HSC активацияһын тормошҡа ашыра ала [47] һәм митохондрияла АТФ етештереүҙе кәметә, был айырым аҡһымдар тарафынан көйләнә йәки индуцированный, мәҫәлән, өҙгөс аҡһымдар (UCP) йәки аденин нуклеотид транслоказаһы (ANT). Күҙәнәк тибына ҡарап, был күренеш күҙәнәктәрҙе апоптоздан һаҡлай һәм/йәки апоптозға булышлыҡ итә ала [46]. Әммә ҡан яһаусы тамыр күҙәнәктәрен инактивациялауҙа митохондрияларҙы өҙөүсе булараҡ ИПА-ның ролен асыҡлау өсөн артабанғы тикшеренеүҙәр кәрәк.
Һуңынан беҙ митохондрия тын алыуындағы үҙгәрештәрҙең тере LX-2 күҙәнәктәрендә митохондрия морфологияһында сағылыш табамы-юҡмы икәнлеген тикшерҙек. Ҡыҙыҡлы, ТГФ-β1 дауалау үҙгәртә митохондрия өлөшө сферик арауыҡ, кәмегән митохондрия тармаҡланыу һәм DRP1 экспрессияһы арта, төп фактор митохондрия бүленә [48]. Бынан тыш, митохондриялар ярсыҡланыу дөйөм селтәр ҡатмарлылығы менән бәйле, һәм синтездан бүленә күсеү ҡан яһаусы тамыр күҙәнәктәрен (HSC) әүҙемләштереү өсөн үтә мөһим, шул уҡ ваҡытта митохондриялар бүленешен тормошҡа ашырыу HSC апоптозына килтерә [49]. Шулай итеп, беҙҙең һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, ТГФ-β1 дауалау тармаҡланыу кәмеүе менән митохондрия селтәре ҡатмарлылығының кәмеүен тыуҙыра ала, был әүҙемләштерелгән ҡан яһаусы тыуым күҙәнәктәре (ГСК) менән бәйле митохондрия бүленешендә йышыраҡ осрай. Бынан тыш, беҙҙең мәғлүмәттәр күрһәтеүенсә, IPA митохондриялар өлөшөн сферик форманан арауыҡ формаһына үҙгәртә ала, шуның менән OPA1 һәм MFN2 экспрессияһын кәметә. Тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, OPA1 нисбәтендә көйләү митохондрия мембранаһы потенциалының кәмеүенә һәм күҙәнәк апоптозын башлауына килтерергә мөмкин [50]. MFN2 митохондриялар синтезы һәм апоптозды медиациялау өсөн билдәле [51]. Һөҙөмтәләр LX-2 күҙәнәктәрен TGF-β1 һәм/йәки IPA ярҙамында индукциялау митохондрия формаһын һәм күләмен, шулай уҡ активлашыу хәлен һәм селтәр ҡатмарлылығын модуляциялай кеүек күренә тип фаразлай.
Беҙҙең һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, комбинациялы дауалау TGFβ-1 һәм IPA мтДНК һәм күҙәнәк морфологик параметрҙарын кәметергә мөмкин мРНК экспрессияһын көйләү фиброз, апоптоз һәм йәшәү менән бәйле гендар апоптоз-ҡасып күҙәнәктәрҙә. Ысынлап та, IPA AKT1 һәм COL1A2 һәм MMP2 кеүек мөһим фиброз гендарының мРНК экспрессияһы кимәлен кәметкән, әммә апоптоз менән бәйле CASP8 экспрессияһы кимәлен арттырған. Беҙҙең һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, IPA дауалауҙан һуң, BAX экспрессияһы кәмей һәм мРНК экспрессияһы TIMP1 ғаилә субъединицалары, BCL-2 һәм NF-κB артты, тип фаразлай IPA ҡан яһаусы тыуым күҙәнәктәрендә (HSCs) йәшәү сигналдарын стимуллаштырыу мөмкин, улар апоптоздан ҡаса. Был молекулалар әүҙемләштерелгән ҡан яһаусы тыуым күҙәнәктәрендә про-йәшәү сигналдары булып эшләй ала, улар анти-апоптотик аҡһымдар экспрессияһының артыуы менән бәйле булыуы мөмкин (мәҫәлән, Bcl-2), про-апоптотик BAX экспрессияһының кәмеүе, һәм TIMP һәм NF-κB араһындағы ҡатмарлы үҙ-ара эш итеү [5, 7]. IPA үҙ эффектын PXR аша күрһәтә, һәм беҙ асыҡланыҡ, тип комбинациялы дауалау менән TGF-β1 һәм IPA PXR мРНК экспрессия кимәлен арттырҙы, HSC активацияһын баҫтырыуҙы күрһәтә. Әүҙемләштерелгән PXR сигнал биреүҙең билдәле булыуынса, HSC активацияһын тормошҡа ашырыу һәм in vivo һәм in vitro [52, 53]. Беҙҙең һөҙөмтәләр күрһәтеүенсә, ИПА апоптозға булышлыҡ итеү, фиброз һәм митохондрия алмашыныуын кәметергә һәм йәшәү сигналдарын көсәйтергә ярҙам итеү юлы менән әүҙемләштерелгән ГСК-ларҙы таҙартыуҙа ҡатнашырға мөмкин, был типик процестар, әүҙемләштерелгән ГСК фенотипын инактивлаштырылғанға үҙгәртә. Тағы бер мөмкин булған аңлатма өсөн потенциаль механизмы һәм роле ИПА апоптоз, тип, ул дисфункциональ митохондрияларҙы йыйып, тәү сиратта митофагия аша (эске юл) һәм тышҡы ТНФ сигнал юл (таблица 1), был туранан-тура бәйле NF-κB йәшәү Figure7 элемент сигнал юл (). Ҡыҙыҡ, IPA-ға бәйле байытылған гендар апоптоз юлында проапоптоз һәм про-йәшәү сигналдарын индуцировать итә ала [54], был IPA был гендар менән үҙ-ара тәьҫир итешеп, апоптоз юлын йәки йәшәү индуцировать мөмкин тип фаразлай. Әммә ИПА-ның ГСК-ны әүҙемләштереү ваҡытында апоптозды йәки йәшәүен нисек индуцирлауы һәм уның механистик юлдары асыҡланмаған булып ҡала.
ИПА — эсәк микробиотаһы аша диетик триптофандан барлыҡҡа килгән микроб метаболиты. Тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, ул эсәк мөхитендә ялҡынһыныуға ҡаршы, антиоксидант һәм эпигенетик көйләү үҙенсәлектәренә эйә.[55] Тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, IPA эсәк барьер функцияһын модуляциялай һәм окислывающий стресс кәметә ала, был уның урындағы физиологик эффекттарына булышлыҡ итә ала.[56] Ысынында, ИПА ҡан әйләнеше аша маҡсатлы ағзаларға ташыла, һәм ИПА триптофан, серотонин һәм индол сығарылыштары менән оҡшаш төп метаболит структураһын бүлешә, шуға күрә ИПА конкурентлы метаболизм яҙмыштары һөҙөмтәһендә метаболизм ғәмәлдәрен башҡара.[52] ИПА ферменттарҙа йәки рецепторҙарҙа бәйләү урындары өсөн триптофандан алынған метаболиттар менән конкуренцияға сыға ала, потенциаль рәүештә ғәҙәти метаболизм юлдарын боҙа. Был уның фармакокинетикаһы һәм фармакодинамикаһы буйынса артабанғы тикшеренеүҙең кәрәклеген асыҡлай, уның дауалау тәҙрәһен яҡшыраҡ аңлау өсөн.[57] Был ҡан яһаусы тамыр күҙәнәктәрҙә лә (ҠТК) була аламы, юҡмы, әлегә билдәһеҙ.
Беҙ өйрәнеүебеҙҙең ҡайһы бер сикләүҙәре барлығын таныйбыҙ. ИПА менән бәйле ассоциацияларҙы махсус тикшерер өсөн беҙ 2-се типтағы шәкәр диабеты (Т2ДМ) менән ауырығандарҙы сығарҙыҡ. Беҙ был беҙҙең табыштарҙы 2-се типтағы шәкәр диабеты һәм бауыр ауырыуҙары менән ауырығандарға киң ҡулланыу мөмкинлеген сикләүен таныйбыҙ. Кеше ҡан һыуытҡысында ИПА-ның физиологик концентрацияһы 1–10 мкМ булһа ла [11, 20], 1 мМ ИПА концентрацияһы иң юғары токсик булмаған концентрацияға [15] һәм апоптоздың иң юғары тиҙлегенә ҡарап һайланған, некротик күҙәнәктәр популяцияһының процентында айырма юҡ. Был тикшеренеүҙең супрафизиологик кимәлдәре ҡулланылған булһа ла, әлеге ваҡытта һөҙөмтәле дозаһы буйынса консенсус юҡ IPA [52]. Беҙҙең һөҙөмтәләр әһәмиәтле булһа ла, киңерәк метаболизм яҙмышы ИПА әүҙем тикшеренеүҙең өлкәһе булып ҡала. Өҫтәүенә, беҙҙең ҡан һыуытҡысында ИПА кимәле һәм бауыр транскрипттарының ДНК метилләшеүе араһындағы бәйләнеш тураһындағы табыштар ҡан яһаусы тамыр күҙәнәктәрҙән (ГСК) ғына түгел, ә бауыр туҡымаларынан да алынған. Беҙ кеше LX-2 күҙәнәктәрен ҡулланыуҙы һайланыҡ, беҙҙең элекке табыштарға нигеҙләнеп, транскриптома анализы, тип IPA менән бәйле гемопоэтик тамыр күҙәнәктәре (HSC) активацияһы [15], һәм HSCs төп күҙәнәктәр ҡатнашҡан прогрессирование бауыр фиброз. Бауыр бер нисә күҙәнәк типтарынан тора, шуға күрә башҡа күҙәнәк моделдәре, мәҫәлән, гепатоцит-HSC-иммун күҙәнәк сокультураһы системаһы менән берләштерелгән каспаза активацияһы һәм ДНК фрагментацияһы, шулай уҡ эшмәкәрлек механизмы, шул иҫәптән аҡһым кимәле ролен өйрәнеү өсөн ҡаралырға тейеш ИПА һәм уның башҡа бауыр күҙәнәктәре тибы менән үҙ-ара тәьҫир итешеү.