Мәҡәлә “Ҡуҙаҡлыларҙың ауырыу тыуҙырыусыларға һәм ҡоротҡостарға ҡаршы тороусанлығын яҡшыртыу” тикшеренеүҙең бер өлөшө булып тора, бөтә 5 мәҡәләне лә ҡарағыҙ
Үҫемлектәрҙең бәшмәк ауырыуы некрозы сәбәпсеһе Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) де Бари төрлө хужа үҫемлектәрҙе зарарлау өсөн күп ҡатлы стратегия ҡуллана. Был тикшеренеүҙең диамин L-орнитин ҡулланыу тәҡдим ителә, аҡһым булмаған аминокислота, башҡа мөһим аминокислоталар синтезын стимуллаштырыу, альтернатив идара итеү стратегияһы булараҡ, Phaseolus vulgaris L. In vitro тәжрибәләре күрһәтеүенсә, L-орнитин S. pyrenoidosa мицелий үҫешен дозаға бәйле рәүештә һиҙелерлек тотҡарлай. Етмәһә, теплица шарттарында аҡ көкөрттөң ауырлығын һиҙелерлек кәметә алыр ине. Бынан тыш, L-орнитин эшкәртелгән үҫемлектәрҙең үҫешен стимуллаштырған, был L-орнитиндың тикшерелгән концентрациялары эшкәртелгән үҫемлектәр өсөн фитотоксик булмауын күрһәтә. Бынан тыш, L-орнитин ферментлы булмаған антиоксиданттар (дөйөм иреткес фенолдар һәм флавоноидтар) һәм ферментлы антиоксиданттар (каталаза (CAT), пероксидаза (POX), һәм полифенол оксидаза (PPO)) экспрессияһын көсәйткән, өс антиоксидант менән бәйле гендар, PGRvD, PvSOAT, һәм PvSO1) экспрессияһын арттырған. 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып S. sclerotiorum геномында фаразланған оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) аҡһым булыуын асыҡлау тора, ул Aspergillus spl. (PlOAH) функциональ анализ, консервацияланған домендар һәм топология йәһәтенән ҙур әһәмиәткә эйә. Шуныһы ҡыҙыҡ: картуф декстроза бульоны (PDB) мөхитенә L-орнитин өҫтәү S. sclerotiorum мицелийында SsOAH генының экспрессияһын һиҙелерлек кәметә. Шулай уҡ L-орнитинды экзоген ҡулланыу эшкәртелгән үҫемлектәрҙән йыйылған бәшмәк мицелийҙарында SsOAH генының экспрессияһын һиҙелерлек кәметкән. Ниһайәт, L-орнитин ҡулланыу PDB уртаса һәм зарарланған япраҡтарҙа ла щавели кислотаһы секрецияһын һиҙелерлек кәметкән. Һүҙҙе йомғаҡлап, L-орнитин окисландырыу-ҡайтарыу статусын һаҡлауҙа, шулай уҡ зарарланған үҫемлектәрҙең оборона яуабын көсәйткәндә төп роль уйнай. Был тикшеренеүҙең һөҙөмтәләре аҡ көкөрт менән көрәштә инновацион, экологик яҡтан таҙа алымдар эшләүҙә һәм уның борсаҡ етештереүгә һәм башҡа культураларға йоғонтоһон йомшартыуҙа ярҙам итер.
Аҡ көкөрт, некротроф бәшмәк Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) де Бари сәбәпле, емергес, уңышты кәметкән ауырыу, глобаль борсаҡ (Phaseolus vulgaris L.) етештереү өсөн етди хәүеф тыуҙыра (Болтон һәм башҡалар, 2006). Sclerotinia sclerotiorum — тупраҡта таралған бәшмәк үҫемлектәренең иң ауыр патогендарының береһе, 600-ҙән ашыу үҫемлек төрөнән торған киң хужа диапазоны һәм хужа туҡымаларын специфик булмаған рәүештә тиҙ мацерациялау мөмкинлеге бар (Лян һәм Роллинс, 2018). Уңайһыҙ шарттарҙа ул үҙенең йәшәү циклының тәнҡитле фазаһын кисерә, тупраҡта ҡара, ҡаты, орлоҡҡа оҡшаш ҡоролоштар булып йәки зарарланған үҫемлектәрҙең мицелийында йәки һабаҡ ҡыуышлығында аҡ, йөнтәҫ үҫемлектәр булып оҙаҡ ваҡыт тынлыҡта ҡала (50). S. sclerotiorum склерозия барлыҡҡа килтерергә һәләтле, был уға зарарланған баҫыуҙарҙа оҙаҡ ваҡыт йәшәргә һәм ауырыу ваҡытында һаҡланырға мөмкинлек бирә (Schwartz et al., 2005). Склероздар туҡлыҡлы матдәләргә бай, тупраҡта оҙаҡ һаҡлана ала, артабанғы инфекциялар өсөн беренсел инокуляция булып хеҙмәт итә (Schwartz et al., 2005). Уңайлы шарттарҙа склеротиялар шытып сыға һәм һауала үҫемлектең ер өҫтөндәге бөтә өлөштәрен, шул иҫәптән, әммә улар менән генә сикләнмәйенсә, сәскәләрҙе, һабаҡтарҙы йәки ҡабыҡтарҙы зарарлай алған споралар етештерә (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum үҙенең хужа үҫемлектәрен зарарлау өсөн күп ҡатлы стратегия ҡуллана, склероздың шытымынан алып симптомдар үҫешенә тиклем бер нисә координацияланған ваҡиғаларҙы үҙ эсенә ала. Тәүҙә S. sclerotiorum апотеция тип аталған бәшмәккә оҡшаш структураларҙан аҫылынып торған споралар (аскоспоралар тип атала) етештерә, улар һауала йөрөп, зарарланған үҫемлек ҡалдыҡтарында хәрәкәтһеҙ склерозияға әүерелә (Bolton et al., 2006). Артабан бәшмәк үҫемлек күҙәнәк диуарының рН-ын контролдә тотоу, ферменттар деградацияһына һәм туҡымаларға инвазияға булышлыҡ итеү өсөн вирулентлыҡ факторы булған щавели кислотаһын бүлеп сығара (Hegedus and Rimmer, 2005), хужа үҫемлектең окисланыу ярсығын баҫа. Был кислоталылыҡ процесы үҫемлек күҙәнәк диуарын көсһөҙләндерә, бәшмәк күҙәнәк диуарын тарҡатыусы ферменттар (CWDEs) нормаль һәм һөҙөмтәле эшләүе өсөн уңайлы мөхит булдыра, патогенға физик барьерҙы еңергә һәм хужа туҡымаларына үтеп инергә мөмкинлек бирә (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum үтеп ингәндән һуң бер нисә CWDE бүлеп сығара, мәҫәлән, полигалактуроназа һәм целлюлоза, улар уның зарарланған туҡымаларҙа таралыуын еңеләйтә һәм туҡыма некрозын тыуҙыра. Ҡатмарлыҡтар һәм гифа маттарының прогрессив үҫеше аҡ көкөрткә хас билдәләргә килтерә (Hegedus and Rimmer, 2005). Шул уҡ ваҡытта хужа үҫемлектәр патоген менән бәйле молекуляр өлгөләрҙе (ПАМФ) өлгөләрҙе таныу рецепторҙары (ПРР) аша таный, сигнал биргән ваҡиғалар теҙмәһен башлай, улар, ахыр сиктә, оборона яуаптарын әүҙемләштерә.
Тиҫтәләгән йылдар сирҙәргә ҡаршы көрәшкә ҡарамаҫтан, башҡа сауҙа культураларындағы кеүек үк, борсаҡта ла тейешле ҡаршы тороусан зародыш плазмаһы етешмәүе һаҡлана, был патогендың ҡаршы тороусанлығы, йәшәүе һәм яраҡлашыусанлығы арҡаһында ҡала. Шуға күрә сирҙәр менән идара итеү ифрат ауыр һәм комплекслы, күп яҡлы стратегия талап итә, ул мәҙәни практика, биологик контроль һәм химик фунгицидтарҙы берләштереүҙе үҙ эсенә ала (О'Салливан һәм башҡалар, 2021). Аҡ көкөрт менән химик көрәш иң һөҙөмтәлеһе, сөнки фунгицидтарҙы дөрөҫ һәм тейешле ваҡытта ҡулланғанда сирҙең таралыуын һөҙөмтәле контролдә тота, инфекцияның ауырлығын кәметә, уңыш юғалтыуҙы минимумға еткерә ала. Әммә артыҡ ҡулланыу һәм фунгицидтарға артыҡ таяныу S. sclerotiorum штаммдарының резистентлығы барлыҡҡа килтерергә мөмкин һәм маҡсатлы булмаған организмдарға, тупраҡ һаулығына, һыу сифатына кире йоғонто яһай (Le Cointe һәм башҡалар, 2016; Ceresini һәм башҡалар, 2024). Шуға күрә экологик яҡтан таҙа альтернативалар табыу өҫтөнлөклө йүнәлешкә әйләнде.
Полиаминдар (ПА), мәҫәлән, путресцин, спермидин, спермин, һәм кадаверин, тупраҡта үҫемлек патогендарына ҡаршы перспективалы альтернатива булып хеҙмәт итә ала, шуның менән тулыһынса йәки өлөшләтә хәүефле химик фунгицидтар ҡулланыуҙы кәметергә (Nehela һәм башҡалар, 2024; Yi20 һәм башҡалар, 2). Юғары үҫемлектәрҙә ПА күп физиологик процестарҙа ҡатнаша, шул иҫәптән, әммә улар менән генә сикләнмәй, күҙәнәктәрҙең бүленеше, дифференциацияһы һәм абиотик һәм биотик көсөргәнештәргә яуап биреүҙе (Киллини һәм Нехела, 2020). Улар антиоксиданттар булып эшләй ала, ярҙам скавендж реактив кислород төрҙәре (РОС), һаҡлау окислы-восстановительный гомеостаз (Нехела һәм Киллини, 2023), индуцировать оборона менән бәйле гендар (Ромеро һәм башҡалар, 2018), төрлө модулировать метаболизм юлдарын көйләү (Нехела һәм Киллини, 20). Киллини, 2019), системалы алынған ҡаршылыҡты (САР) булдырыу, үҫемлектәр менән патогендар үҙ-ара тәьҫир итешеүен көйләү (Нехела һәм Киллини, 2020; Асия һәм башҡалар, 2022; Червонец, 2022). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: үҫемлектәрҙе һаҡлауҙа ПА-лар аныҡ механизмдары һәм ролдәре үҫемлек төрҙәренә, патогендарға һәм тирә-яҡ мөхит шарттарына ҡарап төрлөсә. Үҫемлектәрҙә иң күп осраған ПА кәрәкле полиамин L-орнитиндан биосинтезлана (Киллини һәм Нехела, 2020).
L-орнитин үҫемлектәрҙең үҫешендә һәм үҫешендә күп роль уйнай. Мәҫәлән, алдағы тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, арыш (Oryza sativa), орнитин азотты ҡайтанан эшкәртергә мөмкин (Лю һәм башҡалар, 2018), арыш уңышы, сифаты һәм хуш еҫе (Лу һәм башҡалар, 2020), һыу стресс яуап (Ян һәм башҡалар, 2000). Бынан тыш, экзоген ҡулланыу L-орнитин һиҙелерлек көсәйтелгән ҡоролоҡҡа сыҙамлылыҡ шәкәр сөгөлдөрө (Бета вульгарис) (Хөсәйен һәм башҡалар, 2019) һәм еңеләйткән тоҙ стресс һуған (Allium Cepa) (Чавушоǧлу һәм Чавушоǧдачдиум һәм Чавушогецдиум һәм 2019). Роча һәм башҡалар, 2012). Абиотик стресстан һаҡлауҙа L-орнитиндың потенциаль роле уның эшкәртелгән үҫемлектәрҙә пролин тупланыуында ҡатнашыуы менән бәйле булыуы ихтимал. Мәҫәлән, пролин алмашыныуына бәйле гендар, мәҫәлән, орнитин дельта аминотрансферазаһы (дельта-ОАТ) һәм пролиндегидрогеназаһы (ProDH1 һәм ProDH2) гендары, быға тиклем Nicotiana benthamiana һәм Arabidopsis thalianga үҫемлектәрен хужа булмаған Pse һәм Майсор, 2012 йыл). Икенсе яҡтан, бәшмәк орнитин декарбоксилаза (ODC) патоген үҫеше өсөн кәрәк (Сингх һәм башҡалар, 2020). Фузариум оксиспорум f таргетинг ОДК. сп. lycopersici аша хужа-индуцированный ген тын алыу (HIGS) һиҙелерлек арттырҙы ҡаршы тороусанлыҡ помидор үҫемлектәре Fusarium wilt (Сингх һәм башҡалар, 2020). Әммә фитопатогендар кеүек биотик көсөргәнештәргә ҡаршы экзоген орнитин ҡулланыу потенциаль роле яҡшы өйрәнелмәгән. Тағы ла мөһимерәге, орнитиндың ауырыуҙарға ҡаршы тороусанлыҡҡа һәм уның менән бәйле биохимик һәм физиологик күренештәргә йоғонтоһо күп осраҡта тикшерелмәгән булып ҡала.
Ҡуҙаҡлы культураларҙа S. sclerotiorum инфекцияһының ҡатмарлылығын аңлау һөҙөмтәле контроль стратегияларын эшләү өсөн мөһим. Был тикшеренеүҙең маҡсаты – диамин L-орнитиндың төп фактор булараҡ, ҡуҙаҡлы үҫемлектәрҙең һаҡланыу механизмдарын һәм Sclerotinia sclerotiorum инфекцияһына ҡаршы тороусанлығын көсәйткәндәге потенциаль ролен билдәләү. Беҙ фаразлайбыҙ, зарарланған үҫемлектәрҙең оборона яуаптарын көсәйткәндән тыш, L-орнитин да окисландырыу-ҡайтарыу статусын һаҡлауҙа төп роль уйнай. Беҙ тәҡдим итәбеҙ, потенциаль эффекты L-орнитин ферментлы һәм ферментһыҙ антиоксидант оборона механизмдарын көйләү һәм бәшмәк патогенлығы/вирулентлыҡ факторҙары һәм улар менән бәйле аҡһымдар менән ҡамасаулау менән бәйле. Был икеләтә функциональ L-орнитин уны перспективалы кандидат тотороҡло стратегияһы өсөн аҡ көкөрт йоғонтоһон йомшартыу һәм был көслө бәшмәк патогенына ҡаршы тороусанлыҡты арттырыу өсөн дөйөм ҡуҙаҡлы культуралар. Был тикшеренеүҙең һөҙөмтәләре аҡ көкөрт менән көрәштә һәм уның ҡуҙаҡлылар етештереүгә йоғонтоһон йомшартыуҙа инновацион, экологик яҡтан таҙа алымдар эшләүҙә ярҙам итер.
Был тикшеренеүҙең эксперименталь материалы булараҡ ябай борсаҡтың һиҙгер коммерция сорты — Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Гиза 3) ҡулланылған. Сәләмәт орлоҡтарҙы ҡуҙаҡлылар ғилми-тикшеренеу бүлеге, баҫыу культуралары ғилми-тикшеренеу институты (FCRI), ауыл хужалығы ғилми-тикшеренеу үҙәге (ARC), Мысыр рәхимле итеп бирҙе. Биш орлоҡ теплица шарттарында (25 ± 2 °C, сағыштырмаса дымлылыҡ 75 ± 1%, 8 сәғ яҡтылыҡ/16 сәғ ҡараңғылыҡ) S. sclerotiorum менән зарарланған тупраҡ менән тултырылған пластик һауыттарға (эске диаметры 35 см, тәрәнлеге 50 см) сәселгән. Сәскәндән һуң 7–10 көндә (ДПС) үҫентеләрҙе нәҙегәйтеп, һәр һауытта бер тигеҙ үҫешкән ике үҫенте һәм тулыһынса киңәйгән өс япраҡ ҡына ҡалдыралар. Бөтә һауыттағы үҫемлектәргә ике аҙнаға бер тапҡыр һыу һибелгән һәм бирелгән сорт өсөн тәҡдим ителгән ставка буйынса ай һайын ашлама бирелгән.
500 мг/л концентрациялы L-орнитиндиаминды (шулай уҡ (+)-(S)-2,5-диаминопентан кислотаһы тип атала; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) әҙерләү өсөн тәүҙә 50 мг 100 мл стериль дистиллированный һыуҙа эретелә. Артабан запас иретмәһен һыуытып алалар һәм артабанғы тәжрибәләрҙә ҡулланалар. Ҡыҫҡаһы, алты серия L-орнитин концентрацияһы (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) in vitro тикшерелгән. Бынан тыш, стериль дистиллированный һыу кире контроль булараҡ ҡулланылған (Мок) һәм коммерция фунгициды “Ризолекс-Т” 50% дымлы порошок (токлофос-метил 20% + тирам 30%; КЗ-Кафр Эль Заят Эль Захарт Пестицидтар һәм химик матдәләр компанияһы, Каф булды) ыңғай контроль булараҡ ҡабул ителә. “Ризолекс-Т” коммерция фунгициды биш концентрацияла (2, 4, 6, 8 һәм 10 мг/л) in vitro тикшерелгән.
Коммерция хужалыҡтарынан аҡ көкөрттөң типик билдәләрен күрһәткән ябай борсаҡ һабаҡтары һәм ҡабыҡтары өлгөләре (зарарланыу кимәле: 10–30%) йыйылған. Зарарланған үҫемлек материалдарының күбеһе төр/сорт буйынса билдәләнһә лә (һиҙгер коммерция сорты Гиза 3), башҡалары, бигерәк тә урындағы баҙарҙарҙан алынғандары, билдәһеҙ төрҙәрҙән булған. Йыйылған зарарланған материалдарҙы тәүҙә 3 минут дауамында 0,5 процентлы натрий гипохлориты иретмәһе менән ер өҫтөн дезинфекциялайҙар, һуңынан стериль дистиллированный һыу менән бер нисә тапҡыр йыуалар һәм артыҡ һыуҙы сығарыу өсөн стериль фильтр ҡағыҙы менән ҡоро һөртөп алалар. Һуңынан зарарланған ағзаларҙы урта туҡыманан (һау һәм зарарланған туҡымалар араһында) ваҡ киҫәктәргә ҡырҡып, картуф декстроза агары (КПК) уртаһында үҫтерәләр һәм 25 ± 2 °C температурала 12 сәғәт яҡтылыҡ/12 сәғәт ҡараңғылыҡ циклы менән 5 көн дауамында склерозия барлыҡҡа килтереүҙе стимуллаштыралар. Ҡатнаш йәки бысранған культураларҙан бәшмәк изоляттарын таҙартыу өсөн дә мицелий ос ысулы ҡулланылған. Таҙартылған бәшмәк изоляты тәүҙә уның культура морфологик үҙенсәлектәренә ҡарап билдәләнә, һуңынан микроскопик үҙенсәлектәргә ҡарап S. sclerotiorum икәнлеге раҫлана. Ниһайәт, бөтә таҙартылған изоляттар ҙа Кох постулаттарына яуап бирер өсөн һиҙгер дөйөм борсаҡ сортлы Giza 3-тә патогенлыҡҡа тикшерелде.
Бынан тыш, иң инвазив S. sclerotiorum изоляты (изолят #3) артабан эске транскрипцияланған дистанционник (ITS) секвенирование нигеҙендә раҫланды, тип һүрәтләнгән Уайт һәм башҡалар, 1990; Батуро-Ciesniewska һәм башҡалар, 2017. Ҡыҫҡаһы, изоляттар картуф декстроза бульонында (ПДБ) үҫтерелгән һәм 25 ± 2 °C температурала 5–7 көн инкубацияланған. Артабан бәшмәк мицелийы йыйыла, сырник аша һөҙөлә, ике тапҡыр стериль һыу менән йыуыла һәм стериль фильтр ҡағыҙы менән киптерелә. 1997 йылда геномлы ДНК-ны Quick-DNATM бәшмәк/бактериаль минипреп комплекты ярҙамында айырып алалар (Курамаэ-Изиока, 1997; Аталла һәм башҡалар, 2022, 2024). Һуңынан УНЫҢ рДНК төбәге махсус праймер пары ҡулланып көсәйтелгән УНЫҢ 1/ИТС4 (ТЦЦГТАГГТГААЦТГЦГГ ТЦЦТЦГЦТТАТТГАТТГЦ; көтөлгән күләм: 540 бп) ( Батуро-Циесневская һәм башҡалар, 2017 ). Таҙартылған ПЦР продукттары секвенирование өсөн тапшырылған (Пекин Аоке Диншен Биотехнология Ко., Лтд.). ITS рДНК эҙмә-эҙлеклелеге Сангер эҙмә-эҙлеклелек ысулы менән ике йүнәлештә эҙмә-эҙлеклелеккә алынған. Һуңынан йыйылған эҙләү эҙмә-эҙлеклелеге BLASTn программаһы ярҙамында GenBank һәм Биотехнология мәғлүмәте буйынса милли үҙәктәге (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) һуңғы мәғлүмәттәр менән сағыштырылған. Һорау эҙмә-эҙлеклелеге менән сағыштырылған 20 башҡа S. sclerotiorum штаммдар/изоляттар алынған һуңғы мәғлүмәттәр NCBI GenBank (өҫтәмә таблица S1) ҡулланыу ClustalW молекуляр эволюцион генетика анализ пакеты (MEGA-11; версия 11) (Кумар һәм башҡалар., 20). Эволюцион анализ максималь ихтималлыҡ ысулы һәм дөйөм ваҡытҡа ҡайтарыла торған нуклеотидтарҙы алмаштырыу моделе ҡулланып башҡарылған (Ней һәм Кумар, 2000). Иң юғары лог-ихтималлығы булған ағас күрһәтелә. Эвристик эҙләү өсөн башланғыс ағас һайлау юлы менән ағас һайлау менән юғары лог-ихтималлыҡ араһында күрше-ҡушылыу (NJ) ағасы (Кумар һәм башҡалар, 2024) һәм максималь экономия (МП) ағасы. NJ ағасы дөйөм ваҡытҡа кире ҡайтарыла торған модель ярҙамында иҫәпләнгән парлы арауыҡ матрицаһы ярҙамында төҙөлгән (Ней һәм Кумар, 2000).
L-орнитиндың һәм “Ризолекс-Т” бактерицидының бактерияға ҡаршы эшмәкәрлеге in vitro агар диффузияһы ысулы менән билдәләнгән. Ысулы: тейешле күләмдә запас иретмәһе L-орнитин (500 мг/л) һәм уны 10 мл КПК туҡлыҡлы матдә мөхит менән ныҡлап ҡатыштырып, һуңғы концентрацияһы менән иретмәләр әҙерләү 12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л, ярашлы. Контроль сифатында биш концентрациялағы “Ризолекс-Т” фунгициды (2, 4, 6, 8 һәм 10 мг/л) һәм стериль дистиллированный һыу ҡулланылған. Урталыҡ ҡатҡандан һуң, диаметры 4 мм булған Sclerotinia sclerotiorum культураһының яңы әҙерләнгән мицелий тығынын Петри һауыты үҙәгенә күсерәләр һәм 25±2°С температурала мицелий бөтә контроль Петри һауытын ҡаплағансы үҫтерәләр, шунан һуң бәшмәктәрҙең үҫеше теркәлә. 1-се тигеҙләмә ярҙамында S. sclerotiorum радиаль үҫешенең процент тормошҡа ашырыуын иҫәпләгеҙ:
Тәжрибә ике тапҡыр ҡабатлана, һәр контроль/тәжрибә төркөмө өсөн алты биологик репликация һәм һәр биологик реплика өсөн биш һауыт (бер һауытҡа ике үҫемлек) була. Тәжрибә һөҙөмтәләренең дөрөҫлөгөн, ышаныслылығын һәм ҡабатланыуын тәьмин итеү өсөн һәр биологик реплика ике тапҡыр (ике техник реплика) анализланған. Бынан тыш, яртылаш максималь тормошҡа ашырыу концентрацияһын (IC50) һәм IC99 (Прентис, 1976) иҫәпләү өсөн пробит регрессия анализы ҡулланылған.
Теплица шарттарында L-орнитиндың потенциалын баһалау өсөн бер-бер артлы ике ҡаҙан тәжрибәһе үткәрелгән. Ҡыҫҡаһы, һауыттарға стерилләнгән балсыҡ-ҡом тупрағы (3:1) тултырылған һәм яңы әҙерләнгән S. sclerotiorum культураһы менән прививка яһалған. Беренсенән, S. sclerotiorum-дың иң инвазив изоляты (изолят #3) бер склеротийҙы яртыға ҡырҡып, йөҙө менән аҫҡа ҡаратып КПК-ға ҡуйып, 25°С температурала даими ҡараңғылыҡта (24 сәғәт) 4 көн инкубациялап, мицелий үҫешен стимуллаштырыу юлы менән үҫтерәләр. Һуңынан дүрт 5 мм диаметрлы агар пробкалар алдынғы ситенә алынған һәм 100 г стериль ҡатнашмаһы менән инокуляцияланған бойҙай һәм арыш ҡороттары (1:1, v/v) һәм бөтә колбалар 25 ± 2 °C аҫтында инкубировать 12 h яҡтылыҡ/12 h ҡараңғылыҡ стимулировать daysler циклы өсөн sc 5. Тупраҡ өҫтәр алдынан бер төрлөлөктө тәьмин итеү өсөн бөтә колбаларҙағы әйберҙәрҙе лә яҡшылап бутағандар. Артабан, сир тыуҙырыусылар даими концентрацияһын тәьмин итеү өсөн, һәр ҡаҙанға 100 г колонизациялаусы ҡорот ҡатнашмаһы өҫтәлгән. Инокуляцияланған һауыттарға бәшмәктәрҙең үҫешен әүҙемләштереү өсөн һыу һибәләр һәм 7 көн теплица шарттарында урынлаштыралар.
Артабан һәр һауытҡа Гиза 3 сортының биш орлоғо сәселде. L-орнитин һәм фунгицид Rizolex-T менән эшкәртелгән һауыттар өсөн стерилләнгән орлоҡтарҙы тәүҙә ике сәғәт һыулы иретмәһендә ике берләшмәнең һуңғы IC99 концентрацияһы яҡынса 250 мг/л һәм 50 мг/л, ярашлы рәүештә, ә һуңынан һауала киптерелгәнсе бер сәғәт. Икенсе яҡтан, орлоҡтарҙы кире контроль булараҡ стериль дистиллированный һыуға һалғандар. көндән һуң, тәүге һыу һибеү алдынан, үҫентеләрҙе һирәгәйтеп, һәр һауытта ике генә бөхтә үҫенте ҡалдырҙылар. Өҫтәүенә, S. sclerotiorum менән зарарланыуҙы тәьмин итеү өсөн, бер үк үҫеш стадияһында (10 көн) борсаҡ үҫемлеге һабаҡтары стерилләнгән скальпель ярҙамында ике төрлө урында ҡырҡып алынған һәм һәр яраға яҡынса 0,5 г колонизациялаусы ҡорот ҡатнашмаһы һалынған, артабан инокуляцияланған бөтә сирҙәрҙе үҫтерер өсөн юғары дымлылыҡты стимуллаштырылған. Контроль үҫемлектәр ҙә шулай уҡ яраланған һәм яраға тигеҙ күләмдә (0,5 г) стериль, колонизацияланмаған ҡорот ҡатнашмаһы һалынған һәм сирҙәр үҫеше өсөн мөхитте моделләштереү һәм дауалау төркөмдәре араһында эҙмә-эҙлеклелекте тәьмин итеү өсөн юғары дымлылыҡта тотолған.
Эшкәртеү ысулы: борсаҡ үҫентеләренә 500 мл L-орнитин (250 мг/л) йәки Ризолекс-Т фунгициды (50 мг/л) һыулы иретмәһе менән тупраҡты һуғарыу юлы менән һыу һибәләр, артабан 10 көн арауыҡ менән өс тапҡыр эшкәртәләр. Плацебо менән эшкәртелгән контроль 500 мл стериль дистиллированный һыу менән һуғарылған. Бөтә эшкәртмәләр ҙә теплица шарттарында (25 ± 2°С, 75 ± 1% сағыштырмаса дымлылыҡ, 8 сәғәт яҡтылыҡ/16 сәғәт ҡараңғылыҡ фотопериоды) үткәрелгән. Бөтә һауыттарҙы ике аҙна һайын һыу һибәләр һәм ай һайын баланслы НПК ашламаһы менән эшкәртәләр (20-20-20, 3,6% көкөрт һәм ТЭ микроэлементтары менән; Заин орлоҡтары, Мысыр) 3–4 г/л концентрацияһында япраҡлы һиптереп, аныҡ сорт һәм етештереүсе өсөн тәҡдимдәр буйынса’. Әгәр башҡаса күрһәтелмәһә, тулыһынса киңәйтелгән өлгөргән япраҡтар (2-се һәм 3-сө япраҡтар өҫтән) йыйылған һәр биологик реплика 72 сәғәттән һуң эшкәрткәндән һуң (hpt), гомогенлаштырылған, йыйылған һәм һаҡланған -80 °C артабанғы анализдар өсөн, шул иҫәптән, әммә сикләнмәй, локаль стресс пероксидацияһы, in situ indicative of listochemical. һәм ферментһыҙ антиоксиданттар һәм ген экспрессияһы.
1-9 шкалаһы буйынса (өҫтәмә таблица S2) Пецольдт һәм Диксон шкалаһы буйынса (1996) Теран һәм башҡалар тарафынан үҙгәртелгән. (2006). Ҡыҫҡаһы, борсаҡ үҫемлектәренең һабаҡтарын һәм ботаҡтарын инокуляция нөктәһенән башлап тикшергәндәр, төйөндәр араһындағы һәм төйөндәр буйлап йәрәхәттәрҙең прогрессив үҫешен күҙәткәндәр. Һуңынан лезияның инокуляция нөктәһенән һабаҡ йәки тармаҡ буйлап иң алыҫ нөктәгә тиклемге арауығы үлсәнә һәм лезияның урынлашҡан урынына ҡарап 1–9 балл бирелә, унда (1) лезия нөктәһе янында күренгән инфекция булмауын күрһәткән һәм (2–9) лезияның яйлап прогрессив үҫешен күрһәткән a/S таблицаһы noulong). Һуңынан аҡ көкөрт инфекцияһы интенсивлығы 2-се формула ярҙамында процентҡа үҙгәртелде:
Бынан тыш, сирҙең прогрессив ҡойроғо аҫтындағы майҙан (AUDPC) формулаһы буйынса иҫәпләнгән (Шейнер һәм Финни, 1977), күптән түгел был дөйөм борсаҡтың аҡ сереүе өсөн яраҡлаштырылған (Чаухан һәм башҡалар, 2020) 3-сө тигеҙләмәһен ҡулланып:
Ҡайҙа Yi = сирҙең ауырлығы ti ваҡытта, Yi+1 = сирҙең ауырлығы киләһе ваҡытта ti+1, ti = беренсе үлсәү ваҡыты (көндәрҙә), ti+1 = киләһе үлсәү ваҡыты (көндәрҙә), n = ваҡыт нөктәләре йәки күҙәтеү нөктәләре дөйөм һаны. көн дауамында аҙна һайын борсаҡ үҫемлектәренең үҫеш параметрҙары, шул иҫәптән үҫемлектең бейеклеге (см), бер үҫемлеккә ботаҡтар һаны, бер үҫемлеккә япраҡ һаны бөтә биологик ҡабатлауҙарҙа теркәлгән.
Һәр биологик репликала япраҡ өлгөләре (өҫтән икенсе һәм өсөнсө тулыһынса үҫешкән япраҡтар) эшкәрткәндән һуң 45-се көндә (һуңғы эшкәрткәндән һуң 15 көн үткәс) йыйылған. Һәр биологик реплика биш һауыттан торған (бер һауытҡа ике үҫемлек). Ҡараңғыла 4 °C температурала 80% ацетон ҡулланып, фотосинтез пигменттарын (хлорофилл а, хлорофилл б һәм каротиноидтар) сығарыу өсөн ваҡланған туҡыманан яҡынса 500 мг ҡулланылған. сәғәттән һуң өлгөләр центрифугаланған һәм супернатант хлорофилл а, хлорофилл б һәм каротиноидтар составын колориметрик рәүештә билдәләү өсөн йыйылған УФ-160А спектрофотометр (Shimadzu корпорацияһы, Япония) ысулы буйынса (Lichtentharing threesor the70 the70. тулҡындар оҙонлоғо (А470, А646 һәм А663 нм). Ниһайәт, фотосинтез пигменттарының составы Лихтенталер (1987) тарафынан һүрәтләнгән түбәндәге 4–6 формулалар буйынса иҫәпләнгән.
сәғәттән һуң эшкәрткәндән һуң (hpt) һәр биологик репликаттан водород перекисе (H2O2) һәм супероксид анионының (O2•−) гистохимик локализацияһы өсөн япраҡтар (өҫтән икенсе һәм өсөнсө тулыһынса үҫешкән япраҡтар) йыйыла. Һәр биологик реплика биш һауыттан торған (бер һауытҡа ике үҫемлек). Ысулдың дөрөҫлөгөн, ышаныслылығын һәм ҡабатланыуын тәьмин итеү өсөн һәр биологик реплика дубликатта (ике техник реплика) анализланған. H2O2 һәм O2•− 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Сигма-Ольдрих, Дармштадт, Германия) йәки нитрозәңгәр тетразолий (NBT; Сигма-Ольдрих, Дармштадт, Германия) ҡулланып билдәләнгән, ярашлы рәүештә, Romerotas et P. (2004) һәм Адам һ.б. (1989) ҙур булмаған үҙгәрештәр менән донъя күрә. мМ Трис буферында (рН 7,8) 0,1% ДАБ менән вакуумда листовкалар инфильтрациялана, һуңынан бүлмә температураһында яҡтылыҡта 60 минут инкубациялана. Япраҡсаларҙы 0,15% (күләм/күләм) ТСА-ла 4:1 (күләм/күләм) этанолда:хлороформда (Аль-Гомхория фармацевтика һәм медицина кәрәк-яраҡтары, Ҡаһирә, Мысыр) ағарталар, һуңынан ҡараңғыланғансы яҡтылыҡҡа дусар итәләр. Шулай уҡ, клапандар 10 мМ калий фосфаты буферы (рН 7,8) менән вакуум инфильтрацияланған, составында 0,1 мас./күләм % ГБТ O2•− гистохимик локализацияһы өсөн in situ. Япраҡсаларҙы бүлмә температураһында яҡтылыҡта 20 минут инкубациялайҙар, һуңынан өҫтәгесә ағарталар, ә һуңынан ҡара күк/фиолетовый таптар барлыҡҡа килгәнсе яҡтырталар. Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән көрән (H2O2 күрһәткесе булараҡ) йәки күк-фиолетовый (O2•− күрһәткесе булараҡ) төҫтөң интенсивлығы ImageJ һүрәт эшкәрткән пакеттың Фиджи версияһы ярҙамында баһаланған (http://fiji.sc; 2024 йылдың 7 мартында инеү).
Малондиальдегид (МДА; липидтар пероксидацияһы маркеры булараҡ) Ду һәм Брамлаж (1992) ысулы буйынса бер аҙ үҙгәрештәр индереп билдәләнгән. Һәр биологик репликаттан япраҡтар (өҫтән икенсе һәм өсөнсө тулыһынса үҫешкән япраҡтар) эшкәрткәндән һуң 72 сәғәт үткәс йыйылған (hpt). Һәр биологик репликаға биш һауыт (бер һауытҡа ике үҫемлек) ингән. Ысулдың дөрөҫлөгөн, ышаныслылығын һәм ҡабатланыуын тәьмин итеү өсөн һәр биологик реплика дубликатта (ике техник реплика) анализланған. Ҡыҫҡаһы, 0,5 г ер япраҡ туҡымаһы 20% трихлоруксус кислотаһы (ТСА; MilliporeSigma, Берлингтон, МА, АҠШ) менән МДА экстракцияһы өсөн ҡулланылған, составында 0,01% бутилированный гидрокситолуол (БХТ; Сигма-Олдрич, Сент-Луис, MO, АҠШ). Һуңынан супернатанттағы МДА составы колориметрик ысул менән 532 һәм 600 нм-ҙа абсорбцияны УФ-160А спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярҙамында үлсәү юлы менән билдәләнә һәм артабан нмоль g−1 FW тип күрһәтелә.
Ферментһыҙ һәм ферментлы антиоксиданттарҙы баһалау өсөн һәр биологик репликаттан эшкәрткәндән һуң 72 сәғәттә (hpt) япраҡтар (өҫтән икенсе һәм өсөнсө тулыһынса үҫешкән япраҡтар) йыйыла. Һәр биологик реплика биш һауыттан торған (бер һауытҡа ике үҫемлек). Һәр биологик өлгө дубликатта (ике техник өлгө) анализланған. Ике япраҡ шыйыҡ азот менән тарттырыла һәм туранан-тура ферментлы һәм ферментһыҙ антиоксиданттарҙы, дөйөм аминокислоталарҙы, пролин составын, гендар экспрессияһын һәм оксалаттарҙы билдәләү өсөн ҡулланыла.
Дөйөм иретелгән фенолдар Фолин-Чиокальтеу реагенты (Сигма-Ольдрих, Сент-Луис, штат Моссачусетс, АҠШ) ярҙамында Кахконен һ.б. (1999). Ҡыҫҡаһы, яҡынса 0,1 г гомогенлаштырылған япраҡ туҡымаһы 20 мл 80% метанол менән ҡараңғыла 24 сәғәт экстракциялана һәм центрифугалауҙан һуң супернатант йыйыла. 0,1 мл өлгө экстракты 0,5 мл Фолин-Чиокальтеу реагенты (10%) менән ҡатнаштырыла, 30 с һелкетеп, 5 минут ҡараңғыла ҡалдырыла. Артабан һәр пробиркаға 0,5 мл 20 процентлы натрий карбонаты иретмәһе (Na2CO3; Аль-Гомхория фармацевтика һәм медицина кәрәк-яраҡтары компанияһы, Ҡаһирә, Мысыр) өҫтәп, яҡшылап бутайҙар һәм бүлмә температураһында ҡараңғыла 1 сәғәт инкубациялайҙар. Инкубациянан һуң реакция ҡатнашмаһының абсорбцияһы 765 нм-ҙа УФ-160А спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярҙамында үлсәнә. Өлгө экстракттарында дөйөм иретелгән фенолдар концентрацияһы галлик кислотаһы калибровка ҡойроғо ярҙамында билдәләнгән (Fisher Scientific, Hampton, NH, АҠШ) һәм яңы ауырлыҡтың бер граммына галлик кислотаһы эквиваленты миллиграммы (мг GAE g-1 яңы ауырлыҡ) тип күрһәтелгән.
Дөйөм иретелгән флавоноидтар составы Джеридан һ.б. (2006) әҙ генә үҙгәрештәр индереп, донъя күргән. Ҡыҫҡаһы, 0,3 мл өҫтәге метанол экстракты 0,3 мл 5% алюминий хлориды иретмәһе (AlCl3; Фишер ғилми, Хэмптон, NH, АҠШ) менән ҡатнаштырылған, ныҡлы болғатып, һуңынан бүлмә температураһында 5 минут инкубацияланған, артабан mssiumta10 иретмәһе өҫтәлгән. (Аль-Гомхория фармацевтика һәм медицина кәрәк-яраҡтары, Ҡаһирә, Мысыр), ентекле ҡатнаштырылған һәм бүлмә температураһында 30 минут ҡараңғыла инкубацияланған. Инкубациянан һуң реакция ҡатнашмаһының абсорбцияһы 430 нм-ҙа УФ-160А спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярҙамында үлсәнә. Өлгө экстракттарында дөйөм иретелгән флавоноидтар концентрацияһы рутин калибровка ҡойроғо ярҙамында билдәләнгән (TCI Америка, Портланд, OR, АҠШ) һәм һуңынан миллиграмм рутин эквиваленты грамм яңы ауырлыҡ (мг RE g-1 яңы ауырлыҡ) тип күрһәтелгән.
Фасоль япраҡтарында дөйөм ирекле аминокислоталар составы Йокояма һәм Хирамацу (2003) тәҡдим иткән һәм Sun һ.б. (2006). Ҡыҫҡаһы, 0,1 г ер туҡымаһы рН 5,4 буфер менән экстракцияланған, һәм 200 мкл супернатант 200 мкл нингидрин (2%) һәм 200 мкл пиридин менән реакцияға инә (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, АҠШ өсөн ҡайнатып wath3 мин0. 580 нм-ҙа УФ-160А спектрофотометры (Симадзу корпорацияһы, Япония) ярҙамында үлсәнә. Икенсе яҡтан, пролин Бейтс ысулы менән билдәләнгән (Бейтс һәм башҡалар, 1973). Пролин 3% сульфосалициловая кислота менән экстракцияланған (Термо фәнни химия, Уолтем, М.А., АҠШ) һәм центрифугалауҙан һуң, 0,5 мл супернатант 1 мл боҙло сироп кислотаһы менән ҡатнаштырылған (Фишер фәнни, Хэмптон, NH, АҠШ) һәм нингидрин co insureted at°C һәм incu9d. 520 нм-ҙа өҫтәге кеүек үк спектрофотометр ҡулланып тикшерелә. Япраҡ экстракттарында дөйөм ирекле аминокислоталар һәм пролин глицин һәм пролин калибровка ҡойроҡтары ярҙамында билдәләнгән (Сигма-Ольдрич, Сент-Луис, MO, АҠШ), ярашлы рәүештә, һәм мг/г яңы ауырлыҡта күрһәтелгән.
Антиоксидант ферменттарының ферменталь эшмәкәрлеген билдәләү өсөн яҡынса 500 мг гомогенлаштырылған туҡыма 3 мл 50 мМ Трис буферы (рН 7,8) менән экстракциялана, унда 1 мМ ЭДТА-Na2 (Сигма-Ольдрих, Сент-Луис, МО, АҠШ) һәм 7,5% полилиродиплд Сент-Луис, MO, АҠШ), центрифуга 10,000 × г 20 минут һыуытҡыс аҫтында (4 °C), һәм супернатант (сей фермент экстракты) йыйылған (Эль-Нагар һәм башҡалар, 2023; Ғосман һәм башҡалар, 2023). Каталаза (КАТ) һуңынан 2 мл 0,1 М натрий фосфаты буферы (рН 6,5; Сигма-Ольдрих, Сент-Луис, MO, АҠШ) һәм 100 мкл 269 мМ H2O2 иретмәһе менән реакцияға инә, уның ферменталь эшмәкәрлеген билдәләү өсөн ысул буйынса modification sNagar,Ebi with1. 2023; Ғосман һ.б., 2023). Гуаяколға бәйле пероксидаза (POX) ферменттарының эшмәкәрлеге Harrach һ.б. (2009). (2008) ваҡ үҙгәрештәр менән (Эль-Нагар һәм башҡалар, 2023; Ғосман һәм башҡалар, 2023) һәм ферменталь эшмәкәрлеге полифенол оксидаза (ППО) 2,2 мл 100 мМ натрий фосфаты буферы (рН1TC0cal, gua10s), 2,2 мл реакциянан һуң билдәләнде. Портленд, ОР, АҠШ) һәм 100 мкл 12 мМ H2O2. Ысул бер аҙ үҙгәртелгән (Эль-Нагар һәм башҡалар, 2023; Ғосман һәм башҡалар, 2023). мл катехол иретмәһе (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, М.А., АҠШ) (0,01 М) менән реакциянан һуң анализ 0,1 М фосфат буферында (рН 6,0) яңы әҙерләнгән. 240 нм-ҙа H2O2 тарҡалыуын күҙәтеү юлы менән CAT эшмәкәрлеге үлсәнә (A240), POX активлығы 436 нм-ҙа абсорбцияның артыуын күҙәтеү юлы менән үлсәнә (A436), ә PPO активлығы 495 нм-ҙа абсорбция тирбәлеүҙәрен теркәү юлы менән үлсәнә һәр мин-U300 өсөн U30). спектрофотометр (Симадзу, Япония) ҡулланыла.
Реаль ваҡытта РТ-ПЦР өс антиоксидант менән бәйле гендар транскрипты кимәлен асыҡлау өсөн ҡулланылған, шул иҫәптән пероксисомаль каталаза (PvCAT1; GenBank ҡушылыу No KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank ҡушылыу No XM_06863955). KY195009.1 һанлы ҡушылыу), борсаҡ япраҡтарында (өҫтән икенсе һәм өсөнсө тулыһынса үҫешкән япраҡтар) һуңғы эшкәртелгәндән һуң 72 сәғәт үткәс. Ҡыҫҡаһы, РНК етештереүсе протоколы буйынса Simply P дөйөм РНК экстракцияһы комплекты (Кат. No BSC52S1; BioFlux, Biori технологияһы, Ҡытай) ҡулланып айырылған. Һуңынан, кДНК синтезланған ҡулланып TOP scriptTM кДНК синтезы комплекты етештереүсе күрһәтмәләре буйынса. Өс гендың праймер эҙмә-эҙлеге S3 өҫтәмә таблицаһында бирелгән. PvActin-3 (GenBank ҡушылыу номеры: XM_068616709.1) өй хужалығы гены булараҡ ҡулланылған һәм сағыштырмаса ген экспрессияһы 2-ΔΔCT ысулы менән иҫәпләнгән (Ливак һәм Шмиттген, 2001). Биотик стресс (дөйөм ҡуҙаҡлылар һәм антракноз бәшмәктәре Colletotrichum lindemuthianum араһында ярашмаған үҙ-ара тәьҫир итешеү) һәм абиотик стресс (ҡоролоҡ, тоҙлолоҡ, түбән температура) аҫтында актиндың тотороҡлолоғо күрһәтелгән (Боржес һәм башҡалар, 2012).
1997 йылда был үҫемлектә геном-киң анализды үткәрҙек. 1997 йылда был үҫемлектә оксалоацетат ацетилгидролаза (ОАХ) аҡһымдарын аҡһым-аҡһым БЛАСТ ҡоралы (BLASTp 2.15.0+) ҡулланып үткәрҙек. Ҡыҫҡаһы, беҙ ҡулланған ОАХ Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank ҡушылыу номеры XP_040799428.1; 342 аминокислота) һәм Penicillium lagena (PlOAH2; таксид1банк номеры; XP_056833920.1; 316 аминокислота) эҙләү эҙмә-эҙлеклелеге булараҡ, S. 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып милли биотехнология мәғлүмәте үҙәге (NCBI) сайтында GenBank-тағы S. sclerotiorum геномы мәғлүмәттәре тора.
Бынан тыш, күҙалланған OAH гены S. sclerotiorum (SsOAH) һәм эволюцион анализ һәм филогенетик ағас AfOAH A. fijiensis CBS 313.89 һәм PlOAH P. моделе (Джонс һәм башҡалар, 1992). Филогенетик ағас S. sclerotiorum-дан бөтә күҙалланған OAH гендарының (SsOAH) аҡһым эҙмә-эҙлеклелеген күп тапҡыр тура килтереп анализлау һәм сикләүҙәргә нигеҙләнгән тура килтереүҙең ҡоралы (COBALT; һәм Агарвала, 2007). Бынан тыш, иң яҡшы тап килгән аминокислота эҙмә-эҙлеклелеге SsOAH-тан S. ЭСПрипт ҡоралы (3.0 версияһы; https://эсприпт.ибцп.фр/ЭСПрипт/ЭСПрипт/индекс.фп).
Бынан тыш, S. sclerotiorum SsOAH-тың күҙалланған функциональ вәкиллекле домендары һәм консервацияланған урындары InterPro ҡоралы (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ярҙамында төрлө ғаиләләргә интерактив рәүештә бүленгән (Блум һәм башҡалар, 2021). Һуңғыһы, өс үлсәмле (3D) структура моделләштереү күҙаллана S. sclerotiorum SsOAH аҡһым гомологияһы/аналогия таныу двигателе ярҙамында башҡарылған (Phyre2 сервер версияһы 2.0; 2015) һәм швейцария-моделе серверы ярҙамында раҫланған (Биасини һәм башҡалар, 2014). 1.15-се версия (версия 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) ярҙамында күҙалланған өс үлсәмле структуралар (PDB форматында) интерактив визуализацияланған.
Sclerotinia sclerotiorum мицелийында оксалоацетат ацетилгидролазаның (SsOAH; GenBank ҡушылыу номеры: XM_001590428.1) транскрипция кимәлен билдәләү өсөн миҡдарлы реаль ваҡыттағы флуоресценция ПЦР ҡулланылған. Ҡыҫҡаһы, S. sclerotiorum колбаға инокуляцияланған, составында PDB һәм ҡалтыраныу инкубаторына урынлаштырылған (модель: I2400, Нью-Брансуик фәнни компанияһы, Эдисон, Нью-Джерси, АҠШ) 25 ± 2 °C 24 сәғәт 150 әйләнеш/мин һәм даими ҡараңғылыҡта myceal стимуллаштырыу өсөн (24). Һуңынан күҙәнәктәрҙе L-орнитин һәм фунгицид Rizolex-T менән һуңғы IC50 концентрацияһында (яҡынса 40 һәм 3,2 мг/л, ярашлы рәүештә) эшкәртәләр, һуңынан шул уҡ шарттарҙа тағы ла 24 сәғәт үҫтерәләр. Инкубациянан һуң культураларҙы 2500 әйләнеш/мин тиҙлектә 5 минут центрифугалайҙар һәм ген экспрессияһын анализлау өсөн супернатант (бәшмәк мицелийы) йыйыла. Шулай уҡ бәшмәк мицелийы инфекциянан һуң 0, 24, 48, 72, 96 һәм 120 сәғәттә зарарланған туҡымалар өҫтөндә аҡ көкөрт һәм мамыҡлы мицелий барлыҡҡа килгән зарарланған үҫемлектәрҙән йыйылған. Бәшмәк мицелийынан РНК сығарылған, артабан өҫтә һүрәтләнгәнсә кДНК синтезланған. SsOAH өсөн праймер эҙмә-эҙлеклелеге S3 өҫтәмә таблицаһында бирелгән. SsActin (GenBank ҡушылыу номеры: XM_001589919.1) йорт хужалығы гены булараҡ ҡулланылған, ә сағыштырмаса ген экспрессияһы 2-ΔΔCT ысулы менән иҫәпләнгән (Ливак һәм Шмиттген, 2001).
Сюй һәм Чжан (2000) ысулы буйынса бер аҙ үҙгәрештәр индереп, картуф декстрозаһы бульонында (ПДБ) һәм Sclerotinia sclerotiorum бәшмәк патогены булған үҫемлек өлгөләрендә щелочь кислотаһы билдәләнгән. Ҡыҫҡаһы, S. sclerotiorum изоляттары колбаларға инокуляцияланған, составында PDB һәм һуңынан культуралы ҡалтыраныу инкубаторында (модель I2400, Нью-Брансуик фәнни компанияһы, Эдисон, Нью-Джерси, АҠШ) 150 әйләнеш/мин 25 ± 2 °C стимулировать 3-5 көн дауамында constant g. Инкубациянан һуң, бәшмәк культураһы тәүҙә Whatman #1 фильтр ҡағыҙы аша фильтрлана, һуңынан 2500 әйләнеш/мин тиҙлектә 5 минут центрифугалана, ҡалдыҡ мицелийҙы сығарыу өсөн. Супернатант йыйыла һәм 4°С температурала һаҡлана, артабан оксалаттың миҡдарын билдәләү өсөн. Үҫемлек өлгөләрен әҙерләү өсөн яҡынса 0,1 г үҫемлек туҡымаһы ярсыҡтарын өс тапҡыр дистиллированный һыу менән экстракциялайҙар (һәр тапҡыр 2 мл). Һуңынан өлгөләр 2500 әйләнеш/мин тиҙлектә 5 минут центрифугалана, супернатант ҡоро фильтр аша Whatman No 1 фильтр ҡағыҙы һәм артабан анализлау өсөн йыйыла.
Миҡдар анализы өсөн щелочь кислотаһы, реакция ҡатнашмаһы әҙерләнгән быяла тығынлы пробирка түбәндәге тәртиптә: 0,2 мл өлгө (йәки PDB культураһы фильтраты йәки щелочь кислотаһы стандарт иретмәһе), 0,11 мл бромфенол күк (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical of PA1, Pitts1 m0l. кислотаһы (H2SO4; Аль-Гомхория фармацевтика һәм медицина кәрәк-яраҡтары, Ҡаһирә, Мысыр) һәм 0,176 мл 100 мМ калий дихроматы (K2Cr2O7; TCI химик матдәләр, Портленд, OR, АҠШ), ә һуңынан иретмәне дистистилемедик менән 4,8 мл вагородлы һыуытылған. °C һыу мунсаһында ҡойола. минуттан һуң реакцияны 0,5 мл натрий гидроксиды иретмәһе (NaOH; 0,75 М) өҫтәп туҡтаталар. Реакция ҡатнашмаһының абсорбцияһы (А600) 600 нм-ҙа УФ-160 спектрофотометры (Shimadzu Corporation, Япония) ярҙамында үлсәнә. ПДБ һәм дистиллированный һыу контроль булараҡ ҡулланылған өсөн миҡдар культура фильтраттары һәм үҫемлек өлгөләре, ярашлы рәүештә. Культура фильтраттарында щелочь кислотаһы концентрацияһы, микрограмм щелочь кислотаһы миллилитрында PDB уртаса (мкг.мл−1), һәм япраҡ экстракттарында, микрограмм щелочь кислотаһы грамм яңы ауырлыҡта (мкг.g−1 FW) ҡулланып билдәләнгән щелочный кислотаһы калибровкаһы (Walmicient Walmific Walirmosher, М.А., АҠШ).
Тикшеренеүҙең барышында бөтә тәжрибәләр ҙә тулыһынса осраҡлы дизайн (CRD) буйынса эшләнгән, бер эшкәрткәндә алты биологик реплика һәм бер биологик репликаға биш һауыт (бер һауытҡа ике үҫемлек), әгәр башҡаса күрһәтелмәһә. Биологик репликалар дубликатта (ике техник реплика) анализланған. Техник ҡабатлауҙар шул уҡ тәжрибәнең ҡабатланыусанлығын тикшерер өсөн ҡулланылған, әммә ялған ҡабатлауҙарҙан ҡотолоу өсөн статистик анализда ҡулланылмаған. Мәғлүмәттәр статистик анализ дисперсия анализы ҡулланып (ANOVA) эҙләп Туки-Крамер намыҫлы әһәмиәтле айырма (HSD) тест (р ≤ 0.05). In vitro тәжрибәләре өсөн IC50 һәм IC99 ҡиммәттәре пробит моделе ярҙамында иҫәпләнгән һәм 95% ышаныс интервалдары иҫәпләнгән.
Мысырҙағы Эль-Ғабия губернаһындағы төрлө соя баҫыуҙарынан дөйөм алғанда дүрт изолят йыйылған. КПК мөхитендә бөтә изоляттар ҙа ҡаймаҡлы аҡ мицелий етештерә, ул тиҙ мамыҡ аҡ төҫкә инә (1А һүрәте), һуңынан склероз стадияһында бежевый йәки көрән төҫкә инә. Склеротиктар, ғәҙәттә, тығыҙ, ҡара, шар йәки тәртипһеҙ формала, оҙонлоғо 5,2—7,7 мм, диаметры 3,4—5,3 мм (1-се һүрәт, В). 10-12 көн инкубациянан һуң дүрт изолят 25 ± 2 °C температурала инкубацияланғандан һуң культура мөхите ситендә склерозияның сикле өлгөһөн үҫтерһә лә (һүрәт 1А), улар араһында бер пластинкаға склерозия һаны һиҙелерлек айырыла (Р <0,001), изоляттың иң юғары га.301). 1,53 склеротия бер пластинкаға; Шулай уҡ, изолят #3 башҡа изоляттарға ҡарағанда ПДБ-ла күберәк щавели кислотаһы етештерә (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; һүрәт. 1D). 3-сө изолят фитопатоген бәшмәк Sclerotinia sclerotiorum типик морфологик һәм микроскопик үҙенсәлектәрен күрһәткән. Мәҫәлән, КПК-ла 3-сө изоляттың колониялары тиҙ үҫә, ҡаймаҡлы аҡ (1-се һүрәт А), кире бежевый йәки асыҡ лосось һары-көрән төҫтә була, диаметры 9 см булған пластинканың өҫтөн тулыһынса ҡаплау өсөн 25 ± 2°С температурала 6-7 көн кәрәк була. Үрҙәге морфологик һәм микроскопик үҙенсәлектәргә таянып, 3-сө изолят Sclerotinia sclerotiorum тип билдәләнгән.
1-се һүрәт. Дөйөм ҡуҙаҡлы культураларҙан алынған S. sclerotiorum изоляттарының үҙенсәлектәре һәм патогенлығы. (А) мицелий үҫеше дүрт S. sclerotiorum изоляттары КПК уртаса, (Б) склерозия дүрт S. sclerotiorum изоляттары, (В) склерозия һаны (бер пластинкаға), (Г) щавели кислотаһы секрецияһы PDB уртаса (мкг.мл−1), һәм (Е) ауырыу foler i теплица шарттарында һиҙгер коммерция ҡуҙаҡлылар сорты Гиза 3 үҫешә. Ҡиммәттәр биш биологик ҡабатлау уртаса ± SD күрһәтә (n = 5). Төрлө хәрефтәр дауалау араһында статистик әһәмиәтле айырмаларҙы күрһәтә (р <0,05). (F–H) Типик аҡ көкөрт симптомдары ер өҫтөндәге һабаҡтарында һәм кремнийҙарҙа барлыҡҡа килде, ярашлы рәүештә, 10 көндән һуң изолят менән прививка #3 (dpi). (I) Эволюцион анализ эске транскрипцияланған дистанционник (ИТС) төбәге S. sclerotiorum изолят #3 максималь ихтималлыҡ ысулы ҡулланып башҡарылған һәм 20 эҙләнеүҙең изоляттар/штаммдар менән сағыштырылған Милли биотехнология мәғлүмәт үҙәге (NCBI) базаһынан алынған (httbihps://vwwwm). Кластерлаштырыу һыҙыҡтары өҫтөндәге һандар төбәкте ҡаплауҙы (%), ә кластерлаштырыу һыҙыҡтары аҫтындағы һандар тармаҡ оҙонлоғон күрһәтә.
Бынан тыш, патогенлыҡты раҫлау өсөн алынған дүрт S. sclerotiorum изоляты теплица шарттарында һиҙгер коммерция борсаҡының Giza 3 сортын инокуляциялау өсөн ҡулланылған, был Кох постулаттарына тап килә (1-се һүрәт Е). Бөтә алынған бәшмәк изоляттары патоген булһа ла һәм йәшел борсаҡты зарарлай ала (cv. Гиза 3), типик аҡ көкөрт симптомдары сәбәпсе бөтә ер өҫтөндәге өлөштәрендә (һүрәт. 1F), бигерәк тә һабаҡтарҙа (һүрәт. 1G) һәм стручков (һүрәт. 1H) inoculation (inoculation i3) иң күбе 10 ике бойондороҡһоҙ тәжрибәлә агрессив изолят тапҡан. 3-сө изолятта сирҙең иң юғары ауырлығы (%) борсаҡ үҫемлектәрендә (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, һәм 76,7 ± 3,1 инфекциянан һуң 7, 14 һәм 21 көндә, ярашлы рәүештә; 1F һүрәте).
3-сө иң инвазив S. sclerotiorum изолятын асыҡлау эске транскрипцияланған дистанционник (ITS) секвенированиеһы нигеҙендә артабан раҫланды (1I һүрәт). 3-сө изолят һәм 20 эталон изолят/штамм араһындағы филогенетик анализ улар араһында юғары оҡшашлыҡты (>99%) күрһәтте. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: S. sclerotiorum изоляты #3 (533 н.п.) ҡоро борсаҡ орлоҡтарынан айырылған америка S. OR206374.1; 548 н.б.), был фиолетовый (Matthiola incana) һабаҡ сереүенә килтерә, улар барыһы ла дендрограмманың өҫкө өлөшөндә айырым төркөмләнгән (1I һүрәт). Яңы эҙмә-эҙлеклелек NCBI базаһына һалынған һәм “Склеротиния склеротиорум – YN-25 изоляты” (GenBank-ҡа ҡушылыу номеры PV202792) тип аталған. 3-сө изоляттың иң инвазив изолят булыуын күрергә мөмкин; тимәк, был изолят артабанғы бөтә тәжрибәләрҙә лә өйрәнеү өсөн һайлана.
Диамин L-орнитиндың (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) төрлө концентрацияла (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) S. sclerotiorum изолятына ҡаршы бактерияға ҡаршы эшмәкәрлеге in vitro тикшерелгән. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: L-орнитин бактерияға ҡаршы тәьҫир итә һәм яйлап S. sclerotiorum гифаларының радиаль үҫешен дозаға бәйле рәүештә тотҡарлай (2-се һүрәт А, В). Һыналған иң юғары концентрацияла (125 мг/л), L-орнитин күрһәткән иң юғары мицелий үҫешен тормошҡа ашырыу тиҙлеге (99.62 ± 0.27%; һүрәт 2В), был эквивалентлы булды коммерция фунгицид Rizolex-Т һынау) иң юғары тормошҡа ашырыу тиҙлеге the Figure.0.495; (10 мг/л), оҡшаш һөҙөмтәлелекте күрһәтә.
2-се һүрәт. (А) S. sclerotiorum ҡаршы төрлө концентрациялағы L-орнитиндың антибактериаль эшмәкәрлеген коммерция фунгициды Rizolex-T (10 мг/л) менән сағыштырыу. (В, С) тормошҡа ашырыу тиҙлеге (%) S. sclerotiorum мицелий үҫеше менән эшкәрткәндән һуң төрлө концентрацияла L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 һәм 125 мг/л) йәки Ризолекс-Т (2, 4, 6, 8 һәм мглы), тейешле мг/л. Ҡиммәттәр биш биологик ҡабатлау уртаса ± SD күрһәтә (n = 5). Төрлө хәрефтәр дауалау ысулдары араһындағы статистик айырмаларҙы билдәләй (р <0,05). (D, E) Пробит моделе регрессия анализы L-орнитин һәм коммерция фунгицид Rizolex-T, ярашлы рәүештә. Пробит моделе регрессия һыҙығы ҡаты зәңгәр һыҙыҡ рәүешендә, ә ышаныс интервалы (95%) һыҙыҡлы ҡыҙыл һыҙыҡ рәүешендә күрһәтелгән.
Бынан тыш, пробит регрессия анализы башҡарылған һәм тейешле графиктар күрһәтелгән таблица 1 һәм һүрәттәр 2D,E. Ҡыҫҡаһы, ҡабул итеү ҡалҡыулығы ҡиммәте (y = 2,92x − 4,67) һәм уның менән бәйле әһәмиәтле статистика (Кокс & Снелл R2 = 0,3709, Нагелькерке R2 = 0,4998 һәм р <0,0001; 2D һүрәте) L-орнитиндың коммерцияға ҡаршы сағыштырмаса көсәйтелгән активлығын күрһәтте. фунгицид Ризолекс-Т (у = 1,96х − 0,99, Кокс һәм Снелл Р2 = 0,1242, Нагелькерке Р2 = 0,1708 һәм р <0,0001) (1-се таблица).
1-се таблица. S. sclerotiorum ҡаршы L-орнитин һәм коммерция фунгициды “Rizolex-T” ярты максималь тормошҡа ашырыу концентрацияһы (IC50) һәм IC99 (мг/л) ҡиммәттәре.
Ғөмүмән, L-орнитин (250 мг/л) эшкәртелгән дөйөм борсаҡ үҫемлектәрендә аҡ көкөрт үҫешен һәм ауырлығын эшкәртелмәгән S. sclerotiorum-инфицирланған үҫемлектәр менән сағыштырғанда һиҙелерлек кәметкән (контроль; 3-сө һүрәт А). Ҡыҫҡаһы, сир ауырлығы дауаланмаған зарарланған контроль үҫемлектәр яйлап артһа ла (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, һәм 92,33 ± 3,06%), L-орнитин һиҙелерлек кәметкән сир ауырлығы (%) бөтә тәжрибә барышында ±0,0 (8,0 8,0). 1,00, һәм 26,36 ± 3,07) 7, 14, һәм 21 көндән һуң дауалау (дпт), ярашлы рәүештә (һүрәт 3А). Шулай уҡ, ҡасан S. sclerotiorum-инфицированный борсаҡ үҫемлектәре менән эшкәртелгән 250 мг/л L-орнитин, майҙан аҫтында сир прогрессив ҡойроғо (AUDPC) кәмегән 1274.33 ± 33.13 эшкәртелмәгән контроль 281.03 ± 7.95 ыңғай мг/0 ҡарағанда яҡтылыҡ s . Ризолекс-Т фунгициды (183,61 ± 7,71; 3-сө һүрәт В). Икенсе тәжрибәлә лә ошондай уҡ тенденция күҙәтелгән.
3-сө һүрәт. L-орнитинды экзоген ҡулланыу теплица шарттарында Sclerotinia sclerotiorum сәбәпле ябай борсаҡтың аҡ сереүе үҫешенә йоғонтоһо. (А) сир прогрессив ҡойроғо аҡ көкөрт дөйөм борсаҡ менән дауалауҙан һуң 250 мг/л L-орнитин. (Б) майҙан аҫтында сир прогрессив ҡойроғо (AUDPC) аҡ көкөрт дөйөм борсаҡ менән дауалауҙан һуң L-орнитин. Ҡиммәттәр биш биологик ҡабатлау уртаса ± SD күрһәтә (n = 5). Төрлө хәрефтәр дауалау араһындағы статистик әһәмиәтле айырмаларҙы билдәләй (р <0,05).
250 мг/л L-орнитинды экзоген ҡулланыу 42 көндән һуң үҫемлектең бейеклеген (4-се һүрәт А), бер үҫемлеккә ботаҡтар һанын (4-се һүрәт В), бер үҫемлеккә япраҡ һанын (4С-сы һүрәт) яйлап арттыра. Әммә коммерция фунгициды Rizolex-T (50 мг/л) өйрәнелгән бөтә туҡланыу параметрҙарына иң ҙур йоғонто яһаны, экзоген ҡулланыу 250 мг/л L-орнитин икенсе ҙур йоғонто яһаны, эшкәртелмәгән контроль менән сағыштырғанда (һүрәттәр. 4А–С). Икенсе яҡтан, L-орнитин менән дауалау һиҙелерлек йоғонто яһамаған фотосинтез пигменттары содержаниеһы f хлорофилл а (һүрәт. 4D) һәм хлорофилл б (һүрәт. 4Е), әммә бер аҙ дөйөм каротиноид содержаниеһы артты (0,56 ± 0,03 мг2 мг2 ±03 мг/г fr wt. һәм тиҫкәре контроль менән сағыштырғанда (0g. ыңғай контроль (0,46 ± 0,02 мг/г фр масса; һүрәт. 4F). Ғөмүмән, был һөҙөмтәләр L-орнитиндың эшкәртелгән ҡуҙаҡлылар өсөн фитотоксик булмауын, хатта уларҙы үҫтереүҙе стимуллаштырыуы мөмкинлеген күрһәтә.
4-се һүрәт. Теплица шарттарында Sclerotinia sclerotiorum менән зарарланған борсаҡ япраҡтарының үҫеш үҙенсәлектәренә һәм фотосинтез пигменттарына экзоген L-орнитин ҡулланыу йоғонтоһо. (А) Үҫемлек бейеклеге (см), (Б) Бер үҫемлеккә ботаҡтар һаны, (В) Бер үҫемлеккә япраҡтар һаны, (Г) Хлорофилл а составы (мг г-1 фр мас.), (Д) Хлорофилл б составы (мг г-1 фр мас.), (Е) Дөйөм каротиноидтар составы (мг г-1 фр). Ҡиммәттәр уртаса ± SD биш биологик ҡабатлау (n = 5). Төрлө хәрефтәр дауалау араһында статистик әһәмиәтле айырмаларҙы күрһәтә (р <0,05).
In situ гистохимик локализацияһы реактив кислород төрҙәре (ROS; водород перекисе [H2O2]) һәм ирекле радикалдар (супероксид аниондары [O2•−] рәүешендә күрһәтелгән) асыҡланы, экзоген ҡулланыу L-орнитин (250 мг/л) һиҙелерлек кәметкән тупланыу H2O2 (6.30). нмоль.г−1 ФВ; һүрәт. 5А) һәм O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль.г−1 ФВ; һүрәт. 5В) ике эшкәртелмәгән зарарланған үҫемлектәрҙең тупланыуы менән сағыштырғанда (173,31 ± 12,06 һәм 149,35 ± 7,94 нмоль ре-Втспектлы һәм ре. мг/л коммерция фунгициды Ризолекс-Т (170,12 ± 9,50 һәм 157,00 ± 7,81 нмоль.г−1 фр мас., ярашлы рәүештә) 72 сәғәттә. Юғары кимәлдә H2O2 һәм O2•− hpt аҫтында тупланған (һүрәт 5А, В). Шулай уҡ, ТСА нигеҙендә малондиальдегид (МДА) анализ күрһәтеүенсә, S. sclerotiorum-инфицированный борсаҡ үҫемлектәре тупланған юғары кимәлдә МДА (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) улар япраҡтарында (һүрәт. 5С). Әммә экзоген ҡулланыу L-орнитин липидтар пероксидацияһын һиҙелерлек кәметә, был эшкәртелгән үҫемлектәрҙә МДА составының кәмеүе менән дәлилләнә (33,08 ± 4,00 нмоль.г fr wt).
Һүр. (А) водород перекисе (H2O2; нмоль г-1 FW) 72 л.с., (Б) супероксид анионы (O2•-; нмоль г-1 FW) 72 л.с., (С) малондиальдегид (МДА; нмоль г-1 FW) 72 л.с., (D) дөйөм иретелгән фенолдар (Fg2 h-1) (Е) дөйөм иретелгән флавоноидтар (мг RE g-1 FW) 72 л.с., (F) дөйөм ирекле аминокислоталар (мг г-1 FW) 72 л.с., һәм (G) пролин составы (мг г-1 FW) 72 л.с. Ҡиммәттәр уртаса ± стандарт тайпылыш (уртаса ± SD) 5 биологик ҡабатлау (n = 5) күрһәтә. Төрлө хәрефтәр дауалау араһында статистик әһәмиәтле айырмаларҙы күрһәтә (р <0,05).