Nature.com сайтына ингәнегеҙ өсөн рәхмәт. Һеҙ ҡулланған браузер версияһында CSS ярҙамы сикләнгән. Иң яҡшы һөҙөмтә өсөн браузерҙарығыҙҙы яңы версияһын ҡулланырға кәңәш итәбеҙ (йәки Internet Explorer-ҙа совместимость режимын өҙөргә). Шул арала, даими ярҙам тәьмин итеү өсөн, беҙ сайтты стиль йәки JavaScriptһыҙ күрһәтәбеҙ.
Пропион кислотаһы (ППА) аутизм спектры боҙолоуы кеүек нейроүҫеш боҙолоуҙарында митохондрия дисфункцияһының ролен өйрәнеү өсөн ҡулланыла. ППА митохондрия биогенезын, матдәләр алмашыныуын һәм әйләнешен боҙоуы билдәле. Әммә был механизмдар ҡатмарлы ваҡыт характеры арҡаһында ППА-ның митохондрия динамикаһына, бүленә һәм синтезға йоғонтоһо проблемалы булып ҡала. Бында, беҙ тулыландырыусы миҡдарлы һүрәт төшөрөү ысулдарын ҡулланып, тикшерергә, нисек ППА йоғонто яһай митохондрия ультраструктураһы, морфологияһы, һәм динамикаһы нейрон кеүек SH-SY5Y күҙәнәктәрендә. ППА (5 мМ) митохондрия майҙанының (р <0,01), Ферет диаметры һәм әйләнәһенең (р <0,05), 2-се майҙандың (р <0,01) һиҙелерлек кәмеүенә килтергән. Митохондрия ваҡиғалары локаторын анализлау бүленә һәм синтез ваҡиғаларының һиҙелерлек артыуын (р <0,05) күрһәтә, шуның менән стресс шарттарында митохондрия селтәренең бөтөнлөгөн һаҡлай. Бынан тыш, мРНК экспрессияһы cMYC (р <0,0001), NRF1 (р <0,01), TFAM (р <0,05), STOML2 (р <0,0001) һәм OPA1 (р <0,05) һиҙелерлек кәмегән. 01). Был стресс шарттарында функцияны һаҡлау өсөн митохондрия морфологияһын, биогенезын һәм динамикаһын үҙгәртеп ҡороуҙы күрһәтә. Беҙҙең мәғлүмәттәр митохондрия динамикаһына ППА-ның йоғонтоһо тураһында яңы төшөнсә бирә һәм митохондрия стрессҡа яуап биргәндә ҡатнашҡан ҡатмарлы көйләү механизмдарын өйрәнеү өсөн образдар төшөрөү ысулдарының файҙалылығын билдәләй.
Митохондриялар энергия етештереүҙә һәм биосинтезда типик ролдәренән тыш күҙәнәктең төрлө функцияларында айырылғыһыҙ ҡатнашыусылар булып тора. Митохондрия алмашыныуы кальций сигнал биреүҙең, метаболизм һәм окисландырыу-ҡайтарыу гомеостазының, ялҡынһыныу сигнал биреүҙең, эпигенетик үҙгәрештәрҙең, күҙәнәктәрҙең пролиферацияһының, дифференциацияһының һәм программаланған күҙәнәк үлеменең төп көйләүсеһе булып тора1. Атап әйткәндә, митохондрия алмашыныуы нейрондар үҫеше, йәшәүе һәм функцияһы өсөн үтә мөһим һәм нейропатологияның төрлө күренештәрендә киң ҡатнаша2,3,4.
Һуңғы ун йылда матдәләр алмашыныуы статусы нейрогенездың, дифференциацияның, өлгөрөүҙең һәм пластичлыҡтың үҙәк көйләүсеһе булып килеп сыҡты5,6. Һуңғы ваҡытта митохондриялар морфологияһы һәм динамикаһы митоздың айырыуса мөһим компоненттарына әйләнде, был динамик процесс күҙәнәктәр эсендә һау митохондриялар пулын һаҡлай. Митохондрия динамикаһы митохондрия биогенезы һәм биоэнергетикаһынан алып митохондрия бүленешенә, синтезға, транспортҡа һәм клиренсҡа тиклем ҡатмарлы үҙ-ара бәйле юлдар менән көйләнә7,8. Был интегратив механизмдарҙы боҙоу сәләмәт митохондрия селтәрҙәрен һаҡлауҙы боҙа һәм нейроүҫеш өсөн тәрән функциональ эҙемтәләргә килтерә9,10. Ысынлап та, митохондрия динамикаһының дисрегуляцияһы күп психиатрик, нейродегенератив һәм нейроүҫеш боҙолоуҙарында күҙәтелә, шул иҫәптән аутизм спектры боҙолоуҙары (АСД)11,12.
АСД — ҡатмарлы генетик һәм эпигенетик архитектураға эйә гетероген нейроүҫеш боҙолоуы. АСД-ның нәҫелдән килгәнлеге бәхәсһеҙ, әммә уның нигеҙендә ятҡан молекуляр этиологияһы насар аңлашыла. Клиникаға тиклемге модель, клиник тикшеренеүҙәр һәм күп омик молекуляр мәғлүмәттәр йыйылмаһынан мәғлүмәттәр туплау ASD13,14-тә митохондрия дисфункцияһының дәлилдәрен арттыра. Беҙ быға тиклем геном-киң ДНК метилирование экран башҡарҙы когортаһында пациенттар менән АСД һәм дифференциаль метилированный гендарҙы билдәләне, митохондрия метаболизм юлдары буйлап кластерлаштырылған15. Һуңынан беҙ митохондрия биогенезы һәм динамикаһының үҙәк көйләүселәренең дифференциаль метилләшеүе тураһында хәбәр иттек, был мтДНК күсермәләре һаны артыуы һәм ASD16-ла һейҙек алмашыныуы профиленең үҙгәргәне менән бәйле булды. Беҙҙең мәғлүмәттәр митохондрия динамикаһы һәм гомеостазының АСД патофизиологияһында үҙәк роль уйнауына дәлилдәр арта бара. Шуға күрә митохондрия динамикаһы, морфологияһы һәм функцияһы араһындағы бәйләнеште механистик аңлауҙы яҡшыртыу икенсел митохондрия дисфункцияһы менән айырылып торған неврологик ауырыуҙарҙы дауам иткән тикшеренеүҙең төп маҡсаты булып тора.
Молекуляр ысулдар йыш ҡына митохондрия стрессҡа яуап биреүҙең махсус гендар ролен өйрәнеү өсөн ҡулланыла. Әммә был алым митозлы контроль механизмдарының күп яҡлы һәм ваҡытлы булыуы менән сикләнергә мөмкин. Өҫтәүенә, митохондрия гендарының дифференциаль экспрессияһы функциональ үҙгәрештәрҙең туранан-тура күрһәткесе булып тора, бигерәк тә ғәҙәттә сикләнгән һандағы гендар ғына анализлана. Шуға күрә митохондрия функцияһын һәм биоэнергетиканы өйрәнеү өсөн туранан-тура ысулдар тәҡдим ителә17. Митохондрия морфологияһы митохондрия динамикаһы менән тығыҙ бәйле. Митохондрия формаһы, бәйләнеш һәм структураһы энергия етештереү һәм митохондрия һәм күҙәнәктәрҙең йәшәүе өсөн мөһим5,18. Өҫтәүенә, митоздың төрлө компоненттары митохондрия морфологияһындағы үҙгәрештәргә йүнәлтелгән, улар митохондрия дисфункцияһының файҙалы ос нөктәләре булып хеҙмәт итә ала һәм артабанғы механистик тикшеренеүҙәр өсөн нигеҙ булып тора.
Митохондрия морфологияһын тапшырыу электрон микроскопияһы (ТЭМ) ярҙамында туранан-тура күҙәтергә мөмкин, был күҙәнәк ультраструктураһын ентекле өйрәнергә мөмкинлек бирә. ТЭМ туранан-тура визуализациялай морфологияһы, формаһы һәм структураһы митохондрия cristae айырым митохондриялар асыҡлау, ә тик ген транскрипцияһына таянып, аҡһым экспрессияһы йәки күҙәнәк популяцияларында митохондрия функциональ параметрҙары17,19,20. Бынан тыш, ТЭМ митохондриялар һәм башҡа органеллалар араһындағы үҙ-ара тәьҫир итешеүҙе өйрәнеүҙе еңеләйтә, мәҫәлән, эндоплазматик селтәр һәм аутофагосомалар, улар митохондрия функцияһында һәм гомеостазда төп роль уйнай21,22. Шулай итеп, был ТЭМ-ды аныҡ юлдарға йәки гендарға иғтибар йүнәлткәнсе митохондрия дисфункцияһын өйрәнеү өсөн яҡшы башланғыс нөктә итә. Митохондрия функцияһы нейропатология өсөн көндән-көн актуаль була барған һайын, нейрон моделдәрендә митохондрия морфологияһын һәм динамикаһын туранан-тура һәм миҡдар яғынан өйрәнә белергә кәрәклеге асыҡлана.
Был мәҡәләлә беҙ аутизм спектры боҙолоуында митохондрия дисфункцияһының нейрон моделендә митохондрия динамикаһын тикшерәбеҙ. Беҙ быға тиклем дифференциаль метилирование пропионил-КоА карбоксилаза бета (PCCB) ASD15, субъединица митохондрия пропионил-КоА карбоксилаза ферменты PCC. Дисрегуляция ПКК билдәле булыуынса, пропионил сығарылыштарының ағыулы тупланыуына килтерә, шул иҫәптән пропион кислотаһы (ППА)23,24,25. 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып нейрондар алмашыныуын боҙоу һәм тәртипте үҙгәртеү тора. Өҫтәүенә, ППА митохондрия мембранаһы потенциалын боҙоу тураһында хәбәр ителә, биогенез һәм тын алыу in vitro һәм нейрондарҙа митохондрия дисфункцияһын моделләштереү өсөн киң ҡулланыла29,30. Әммә ППА-индуцированный митохондрия дисфункцияһының митохондрия морфологияһына һәм динамикаһына йоғонтоһо насар аңлашыла.
Был тикшеренеүҙең тулыландырыусы һүрәт төшөрөү ысулдары ҡулланыла, SH-SY5Y күҙәнәктәрендә митохондрия морфологияһына, динамикаһына һәм функцияһына ППА-ның йоғонтоһон һанлаштырыу өсөн. Беренсенән, беҙ митохондрия морфологияһы һәм ультраструктураһында үҙгәрештәрҙе күрһәтеү өсөн ТЭМ ысулын эшләнек17,31,32. Митохондрия33 динамик тәбиғәтен иҫәпкә алып, беҙ шулай уҡ митохондрия ваҡиға локализаторы (МЭЛ) анализ ҡулланып, бүленә һәм синтез ваҡиғалары араһындағы баланс үҙгәрештәрен һанлаштырыу өсөн, митохондрия һаны һәм күләме аҫтында ППА стресс. Ниһайәт, беҙ митохондрия морфологияһы һәм динамикаһы биогенезда, бүленештә һәм синтезда ҡатнашҡан гендар экспрессияһында үҙгәрештәр менән бәйлеме-юҡмы икәнлеген тикшерҙек. Беҙҙең мәғлүмәттәрҙе бергә йыйып ҡарағанда, митохондрия динамикаһын көйләүсе механизмдар ҡатмарлылығын асыҡлау мәсьәләһен күрһәтә. Беҙ SH-SY5Y күҙәнәктәрендә митоздың үлсәүле конвергент ос нөктәһе булараҡ митохондрия морфологияһын өйрәнеүҙә ТЭМ-дың файҙаһын билдәләйбеҙ. Өҫтәүенә, беҙ билдәләйбеҙ, ТЭМ мәғлүмәттәре иң бай мәғлүмәт бирә, ҡасан һүрәт төшөрөү ысулдары менән берләштерелгән, улар шулай уҡ динамик ваҡиғаларҙы тотоп, метаболизм стресс яуап. Нейрон күҙәнәктәренең митозын тәьмин итеүсе молекуляр көйләү механизмдарына артабан характеристика биреүҙең нервы системаһының митохондрия компоненты һәм нейродегенератив ауырыуҙар тураһында мөһим төшөнсәләр бирергә мөмкин.
Митохондрия стрессын тыуҙырыу өсөн SH-SY5Y күҙәнәктәре 3 мМ һәм 5 мМ натрий пропионаты (NaP) ҡулланып ППА менән эшкәртелгән. ТЭМ-ға тиклем өлгөләрҙе юғары баҫымда туңдырыу һәм туңдырыу ярҙамында криоген өлгө әҙерләүгә дусар иткәндәр (1а һүрәт). Беҙ автоматлаштырылған митохондрия һүрәтен анализлау торбаһы эшләнек, өс биологик репликалар буйынса митохондрия популяцияларының һигеҙ морфологик параметрҙарын үлсәү өсөн. Беҙ асыҡланыҡ, тип ППА дауалау һиҙелерлек үҙгәртә дүрт параметр: майҙаны 2, майҙаны, периметры, һәм Ферет диаметры (һүрәт. 1б–д). 2-се майҙан һиҙелерлек кәмегән һәм 3 мМ һәм 5 мМ ППА эшкәрткән (р = 0,0183 һәм р = 0,002, ярашлы рәүештә) (һүрәт. 1б), шул уҡ ваҡытта майҙан (р = 0,003), периметр (р = 0,0106) һәм Ферет диаметры һиҙелерлек кәмегән. мМ дауалау төркөмөндә контроль төркөм менән сағыштырғанда һиҙелерлек кәмеү (р = 0,0172) булды (һүрәт 1в–д). Майҙан һәм әйләнәнең һиҙелерлек кәмеүе 5 мМ ППА менән эшкәртелгән күҙәнәктәрҙә бәләкәйерәк, түңәрәк митохондриялар булыуын, был митохондриялар контроль күҙәнәктәргә ҡарағанда әҙерәк оҙонса булыуын күрһәткән. Был шулай уҡ Ферет диаметрының һиҙелерлек кәмеүе менән тап килә, был бойондороҡһоҙ параметр киҫәксәләр ситтәре араһындағы иң ҙур арауыҡтың кәмеүен күрһәтә. Ҡырсыҡтар ультраструктураһында үҙгәрештәр күҙәтелә: ППА көсөргәнеше йоғонтоһонда ҡыуышлыҡтар һирәгерәк һиҙелә башлай (1а һүрәт, В панелендә). Әммә бөтә һүрәттәрҙә лә кристалар ультраструктураһы асыҡ сағылдырылмаған, шуға күрә был үҙгәрештәргә миҡдар анализы үткәрелмәгән. Был ТЭМ мәғлүмәттәре өс мөмкин булған сценарийҙы сағылдырыуы мөмкин: (1) ППА бүленеште көсәйтә йәки синтезды тотҡарлай, был булған митохондриялар күләме буйынса ҡыҫҡарыуына килтерә; 2) көсәйтелгән биогенез яңы, бәләкәйерәк митохондриялар барлыҡҡа килтерә йәки 3) ике механизмды ла бер юлы индуцирлай. Был шарттарҙы ТЭМ менән айырып булмаһа ла, әһәмиәтле морфологик үҙгәрештәр ППА стрессы аҫтында митохондрия гомеостазы һәм динамикаһының үҙгәргәнен күрһәтә. Һуңынан беҙ был динамиканы һәм улар нигеҙендә ятҡан потенциаль механизмдарҙы артабан характерлау өсөн өҫтәмә параметрҙарҙы тикшерҙек.
Пропион кислотаһы (ППА) митохондрия морфологияһын үҙгәртә. (а) вәкиллекле тапшырыу электрон микроскопияһы (ТЭМ) һүрәттәре күрһәтеүенсә, митохондриялар күләме кәмей һәм митохондриялар бәләкәйерәк һәм түңәрәк булып, ППА дауалау арта; 0 мМ (эшкәртелмәгән), ярашлы рәүештә 3 мМ һәм 5 мМ. Ҡыҙыл уҡтар митохондрияларҙы күрһәтә. (б-д) SH-SY5Y күҙәнәктәре менән эшкәртелгән ППА 24 сәғәт ТЭМ өсөн әҙерләнгән һәм һөҙөмтәләр анализланған ҡулланыу Fiji/ImageJ. Һигеҙ параметрҙан дүртеһе контроль (эшкәртелмәгән, 0 мМ ППА) һәм эшкәртелгән (3 мМ һәм 5 мМ ППА) күҙәнәктәр араһында һиҙелерлек айырма күрһәткән. б) 2-се төбәк, в) майҙан, г) периметр, д) Ферет диаметры. Дисперсияның бер яҡлы анализы (контроль ҡаршы дауалау) һәм Даннеттың күп тапҡыр сағыштырыу тесты әһәмиәтле айырмаларҙы билдәләү өсөн ҡулланылған (р <0,05). Мәғлүмәт нөктәләре һәр айырым күҙәнәк өсөн уртаса митохондрия ҡиммәтен күрһәтә, ә хата һыҙыҡтары уртаса ± SEM күрһәтә. Күрһәтелгән мәғлүмәттәр n = 3, бер ҡабатлауҙа кәмендә 24 күҙәнәкте күрһәтә; дөйөм алғанда 266 һүрәт анализланған; * р <0,05, ** р <0,01 күрһәтә.
Артабан характеристика бирергә, нисек митохондрия динамикаһы яуап бирә ППА, беҙ митохондрия менән буялған тетраметилродамин этил эфиры (ТМРЭ) һәм ҡулланылған ваҡыт арауығы микроскопияһы һәм МЭЛ анализ локалләштереү һәм миҡдарҙы билдәләү өсөн митохондрия 24 сәғәттән һуң 3 һәм 5 мМ ППА. Бүленеү һәм синтез ваҡиғаларын дауалау. (2-се һүрәт, а). МЭЛ анализынан һуң митохондриялар артабан анализлана, митохондрия структураларының һанын һәм уларҙы уртаса күләмен һанлаштыралар. Беҙ 3 мМ [4,9 ± 0,3 (р <0,05)] бүленә [5,6 ± 0,3 (р <0,05) )] һәм синтез [5,4 ± 0,5 (р <0,0.5)] һәм синтез [5,4 ± 0,5 (р <0,0.5)] һәм синтез менән сағыштырғанда, ҙур булмаған, әммә һиҙелерлек артыуын күҙәттек. 0,05)] <0,05)] ваҡиғалар һиҙелерлек арттырылған 5 мМ контроль менән сағыштырғанда (һүрәт. 3б). Митохондриялар һаны һиҙелерлек артты һәм 3 [32,6 ± 2,1 (р <0,05)] һәм 5 мМ [34,1 ± 2,2 (р <0,05)] (һүрәт. 3в) , шул уҡ ваҡытта уртаса күләме һәр митохондрия структураһы үҙгәрешһеҙ ҡалды (һүрәт 3c). 3г). Был һүҙҙәрҙе бергә йыйып ҡарағанда, митохондрия динамикаһын үҙгәртеп ҡороу митохондрия селтәренең бөтөнлөгөн уңышлы һаҡлаусы компенсатор яуап булып хеҙмәт итә тип фаразлай. мМ ППА-ла бүленеш ваҡиғаларының артыуы митохондриялар һаны артыуы өлөшләтә митохондриялар бүленешенә бәйле тип фаразлай, әммә уртаса митохондриялар күләменең асылда үҙгәрешһеҙ ҡалыуын иҫәпкә алғанда, биогенезды өҫтәмә компенсатор яуап тип инҡар итеп булмай. Әммә был мәғлүмәттәр ТЭМ күҙәтелгән бәләкәйерәк, түңәрәк митохондрия структуралары менән тап килә һәм шулай уҡ ППА индуцированный митохондрия динамикаһында һиҙелерлек үҙгәрештәрҙе күрһәтә.
Пропион кислотаһы (ППА) селтәрҙең бөтөнлөгөн һаҡлау өсөн динамик митохондриялар ремоделләүен индуцирлай. SH-SY5Y күҙәнәктәре культураланған, 3 һәм 5 мМ ППА менән 24 сәғәт эшкәртелгән һәм TMRE һәм Hoechst 33342 менән буялған, унан һуң MEL анализы үткәрелгән. (а) вәкиллекле ваҡыт арауығы микроскопияһы һүрәттәре һүрәтләү төҫ һәм бинарлаштырылған максималь интенсивлыҡ проекциялары ваҡытта 2 (t2) һәр шарт өсөн. Һайланған төбәктәр күрһәтелгән һәр бинар һүрәттә көсәйтелгән һәм өс төрлө ваҡыт рамкаларында (t1-t3) 3D күрһәтелә, ваҡыт үткән һайын динамиканы иллюстрациялау өсөн; синтез ваҡиғалары йәшел төҫ менән айырылып тора; бүленә торған ваҡиғалар йәшел төҫ менән айырылып тора. Ҡыҙыл төҫтә күрһәтелә. б) Бер шартҡа уртаса динамик ваҡиғалар һаны. в) Бер күҙәнәктә митохондрия структураларының уртаса һаны. (d) Уртаса күләме (мкм3) һәр митохондрия структураһы бер күҙәнәк. Күрһәтелгән мәғлүмәттәр n = 15 күҙәнәктәрҙең бер дауалау төркөмөнә вәкилдәре. мкм, * р <0,05. Хата һыҙыҡтары күрһәтелгән уртаса ± SEM, масштаб һыҙығы = 10 мкм.
Пропион кислотаһы (ППА) митохондрия динамикаһы менән бәйле гендарҙы транскрипцион баҫтырыуҙы тыуҙыра. SH-SY5Y күҙәнәктәре 3 һәм 5 мМ ППА менән 24 сәғәт эшкәртелгән. Сағыштырмаса ген миҡдарын билдәләү RT-qPCR ҡулланып башҡарылған һәм B2M нормалаштырылған. Митохондрия биогенезы гендары (а) cMYC, (б) TFAM, (в) NRF1 һәм (г) NFE2L2. Митохондриялар синтезы һәм бүленә гендары (д) STOML2, (е) OPA1, (ж) MFN1, (з) MFN2 һәм (i) DRP1. Һис шикһеҙ, был айырмалар (р <0,05) бер яҡлы ANOVA (контроль ҡаршы дауалау) һәм Даннеттың күп тапҡыр сағыштырыу тесты ҡулланып тикшерелде: * р <0,05 күрһәтә, ** р <0,01 күрһәтә, һәм **** р <0,0001 күрһәтә. Барҙар уртаса күрһәткес ± SEM күрһәтә. Күрһәтелгән мәғлүмәттәр n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) һәм n = 5 (МФН1, МФН2, ДРП1) биологик репликаларҙы күрһәтә.
ТЭМ һәм МЭЛ анализдарынан алынған мәғлүмәттәр бергә ППА-ның митохондрия морфологияһын һәм динамикаһын үҙгәртеүен күрһәтә. Әммә был һүрәт төшөрөү алымдары был процестарҙы етәкләгән төп механизмдарҙы аңларға мөмкинлек бирмәй. Шуға күрә беҙ мРНК экспрессияһын тикшерҙе туғыҙ төп регуляторҙары митохондрия динамикаһы, биогенез, һәм митоз яуап ППА дауалау. Беҙ күҙәнәк миелома онкоген (cMYC), ядро ​​тын алыу факторы (NRF1), митохондрия транскрипцияһы факторы 1 (TFAM), NFE2-кеүек транскрипция факторы BZIP (NFE2L2), гастрин-кеүек аҡһым 2 (STOML2), күҙ нервыһы атрофияһы 1 (OPA1), Митофу1 динамин менән бәйле аҡһым 1 (DRP1) 24 сәғәт 3 мМ һәм 5 мМ ППА менән эшкәрткәндән һуң. Беҙ 3 мМ (р = 0,0053, р = 0,0415 һәм р <0,0001, ярашлы рәүештә) һәм 5 мМ (р = 0,0031, р = 0,0233, р <0,0001) ППА дауалауҙы күҙәттек. (3-сө һүрәт, а–в). мРНК экспрессияһының кәмеүе дозаға бәйле була: cMYC, NRF1 һәм TFAM экспрессияһы 3 мМ-да ярашлы рәүештә 5,7, 2,6 һәм 1,9 тапҡырға, 5 мМ-да 11,2, 3 һәм 2,2 тапҡырға кәмей. Ҡаршылыҡлы, үҙәк редокс биогенез гены NFE2L2 үҙгәртелмәгән бер ниндәй ҙә концентрацияһы ППА, әммә оҡшаш доза-зависимый тенденцияһы кәмеүе күҙәтелгән экспрессия (һүрәт. 3d).
Беҙ шулай уҡ бүленеш һәм синтезды көйләүҙә ҡатнашҡан классик гендар экспрессияһын тикшерҙек. STOML2 синтез, митофагия һәм биогенезда ҡатнаша тип уйлана, уның экспрессияһы 3 мМ (2,4 тапҡыр үҙгәреш) һәм 5 мМ (2,8 тапҡыр үҙгәреш) ППА (1-се һүрәт) менән һиҙелерлек кәмегән (р <0,0001). 3г). Шулай уҡ, OPA1 синтез ген экспрессияһы 3 мМ (1,6 тапҡыр үҙгәреш) һәм 5 мМ (1,9 тапҡыр үҙгәреш) ППА (р = 0,006 һәм р = 0,0024, ярашлы рәүештә) кәмегән (һүрәт. 3е). Әммә беҙ 24 сәғәтлек ППА стресс аҫтында синтез гендарының экспрессияһында һиҙелерлек айырмалар тапманыҡ MFN1, MFN2 йәки бүленеш гены DRP1 (һүрәт. 3g–i). Бынан тыш, беҙ дүрт синтез һәм бүленеш аҡһымдарының (OPA1, MFN1, MFN2 һәм DRP1) кимәленең бер үк шарттарҙа үҙгәрмәүен асыҡланыҡ (4а–г һүрәт). Шуныһы мөһим: был мәғлүмәттәр ваҡыттың бер нөктәһен сағылдыра һәм ППА стрессының тәүге этаптарында аҡһым экспрессияһында йәки эшмәкәрлек кимәлендәге үҙгәрештәрҙе сағылдырмауы ихтимал. Әммә cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 һәм OPA1 экспрессияһының һиҙелерлек кәмеүе митохондрия алмашыныуының, биогенездың һәм динамикаһының һиҙелерлек транскрипцион дисрегуляцияһын күрһәтә. Бынан тыш, был мәғлүмәттәр митохондрия функцияһында аҙаҡҡы хәл үҙгәрештәрен туранан-тура өйрәнеү өсөн һүрәт төшөрөү алымдарының файҙалылығын билдәләй.
Пропион кислотаһы (ППА) менән эшкәрткәндән һуң синтез һәм бүленеш факторы аҡһым кимәле үҙгәрмәгән. SH-SY5Y күҙәнәктәре 3 һәм 5 мМ ППА менән 24 сәғәт эшкәртелгән. Аҡһым кимәле вестерн-блот анализы ярҙамында һанлаштырылған, ә экспрессия кимәле дөйөм аҡһымға нормалаштырылған. Уртаса аҡһым экспрессияһы һәм маҡсатлы һәм дөйөм аҡһымдың вәкиллекле вестерн-блоттары күрһәтелгән. а – ОПА1, б – МФН1, в – МФН2, г – ДРП1. Барҙар уртаса күрһәтә ± SEM, һәм күрһәтелгән мәғлүмәттәр n = 3 биологик репликалар вәкилдәре. Күп тапҡыр сағыштырыуҙар (р <0,05) дисперсияның бер яҡлы анализы һәм Даннет тесты ярҙамында башҡарылған. Тәүге гель һәм блот күрһәтелгән һүрәттә S1.
Митохондрия дисфункцияһы күп системалы ауырыуҙар менән бәйле, матдәләр алмашыныуы, йөрәк-ҡан тамырҙары һәм мускул ауырыуҙарынан алып неврологик ауырыуҙарға тиклем1,10. Күп кенә нейродегенератив һәм нейродегенератив ауырыуҙар митохондриялар дисфункцияһы менән бәйле, был органеллалар мейенең бөтә ғүмере буйы әһәмиәтен билдәләй. Был сирҙәргә Паркинсон, Альцгеймер һәм АСД3,4,18 инә. Әммә был ауырыуҙарҙы өйрәнеү өсөн мейе туҡымаһына инеү ҡыйын, бигерәк тә механистик кимәлдә, күҙәнәкле модель системаларын кәрәкле альтернативаға әйләндерә. Был тикшеренеүҙең, беҙ күҙәнәкле модель системаһын ҡулланып, PPA-эшкәртелгән SH-SY5Y күҙәнәктәрен ҡабатлау өсөн нейрон ауырыуҙарында күҙәтелгән митохондрия дисфункцияһы, бигерәк тә аутизм спектры боҙолоуҙары. Был ППА моделен ҡулланып, нейрондарҙа митохондрия динамикаһын өйрәнеү АСД этиологияһын аңлау мөмкинлеген бирә ала.
Беҙ митохондрия морфологияһындағы үҙгәрештәрҙе ҡарау өсөн ТЭМ ҡулланыу мөмкинлеген тикшерҙек. Шуныһы мөһим: ТЭМ-ды дөрөҫ ҡулланырға кәрәк, уның һөҙөмтәлелеген арттырыу өсөн. Крио-өлгөләрҙе әҙерләү күҙәнәк компоненттарын бер үк ваҡытта нығытыу һәм артефакттар барлыҡҡа килтереүҙе кәметеү юлы менән нейрон структураларын яҡшыраҡ һаҡларға мөмкинлек бирә34. Был йәһәттән беҙ нейронға оҡшаш SH-SY5Y күҙәнәктәренең субклетка органеллалары һәм оҙонса митохондриялар бөтөн булыуын күҙәттек (1а һүрәт). Был нейрон күҙәнәктәре моделдәрендә митохондрия морфологияһын өйрәнеү өсөн криоген әҙерләү алымдарының файҙалылығын билдәләй. ТЭМ мәғлүмәттәрен объектив анализлау өсөн миҡдар үлсәүҙәре үтә мөһим булһа ла, митохондрия морфологик үҙгәрештәрен раҫлау өсөн ниндәй аныҡ параметрҙарҙы үлсәргә кәрәклеге тураһында әлегә берҙәм фекер юҡ. Күп һанлы тикшеренеүҙең нигеҙендә, улар һанлы тикшерелгән митохондрия морфологияһы17,31,32, беҙ автоматлаштырылған митохондрия һүрәтен анализлау торбаһы эшләгән, һигеҙ морфологик параметрҙарҙы үлсәй, атап әйткәндә: майҙан, майҙан2, формат нисбәте, периметр, түңәрәклек, дәрәжәһе , Ферет диаметры. һәм түңәрәклек.
Улар араһында ППА 2-се майҙанды, майҙанды, периметрҙы һәм Ферет диаметрын һиҙелерлек кәметкән (1-се һүрәт, б–д). Был митохондриялар бәләкәйерәк һәм түңәрәкләнеп киткәнен күрһәтте, был 72 сәғәт PPA30-индуцированный митохондрия стрессынан һуң митохондрия майҙанының кәмеүен күрһәткән элекке тикшеренеүҙәр менән тап килә. Был морфологик үҙенсәлектәр митохондрияның бүленешен күрһәтә ала, митохондрия селтәренән зыян күргән компоненттарҙы секвестрлау өсөн кәрәкле процесс, уларҙы митофагия аша тарҡатыуға булышлыҡ итеү өсөн35,36,37. Икенсе яҡтан, уртаса митохондриялар ҙурлығының кәмеүе биогенездың артыуы менән бәйле булыуы мөмкин, һөҙөмтәлә бәләкәй тыуған митохондриялар барлыҡҡа килә. Бүленеүҙең йәки биогенездың артыуы митохондрия стресына ҡаршы митозды һаҡлау өсөн компенсатор яуапты күрһәтә. Әммә митохондриялар үҫешенең кәмеүен, синтездың боҙолоуын йәки башҡа хәлдәрҙе лә инҡар итеп булмай.
ТЭМ ярҙамында булдырылған юғары асыҡлыҡтағы һүрәттәр айырым митохондриялар кимәлендә морфологик үҙенсәлектәрҙе билдәләргә мөмкинлек бирһә лә, был ысул бер ваҡыт нөктәһендә ике үлсәмле снимоктар етештерә. Өйрәнеү өсөн динамик яуаптар метаболизм стресс, беҙ буялған митохондрия менән TMRE һәм ҡулланылған ваҡыт үткәреү микроскопияһы менән MEL анализ, был юғары етештереүсәнлекле 3D визуализация үҙгәрештәр митохондрия селтәрендә time33,38 мөмкинлек бирә. Беҙ нескә, әммә әһәмиәтле үҙгәрештәр күҙәткән митохондрия динамикаһы аҫтында ППА стресс (һүрәт. 2). мМ-да бүленә торған ваҡиғалар һаны һиҙелерлек арта, ә синтез ваҡиғалары контролдәге кеүек үк ҡала. мМ ППА-ла бүленә һәм синтез ваҡиғаларының да артыуы күҙәтелә, әммә был үҙгәрештәр яҡынса пропорциональ була, был бүленә һәм синтез кинетикаһының юғары концентрацияларҙа тигеҙлеккә етеүен күрһәтә (2-се һүрәт, б). һәм 5 мМ ППА-ла ла уртаса митохондрия күләме үҙгәрешһеҙ ҡала, был митохондрия селтәренең бөтөнлөгө һаҡланғанын күрһәтә (2-се һүрәт, г). Был динамик митохондрия селтәрҙәренең селтәрҙәрҙең тарҡалыуына килтермәйенсә гомеостазды һөҙөмтәле һаҡлау өсөн еңел метаболизм стрессына яуап бирергә һәләтлелеген сағылдыра. мМ ППА-ла бүленештең артыуы яңы тигеҙлеккә күсеүгә булышлыҡ итеү өсөн етә, әммә ППА-ның юғары концентрацияһы арҡаһында барлыҡҡа килгән көсөргәнешкә яуап итеп тәрән кинетик ремоделләү талап ителә.
Митохондриялар һаны ике ППА стресс концентрацияһында ла артты, әммә уртаса митохондриялар күләме һиҙелерлек үҙгәрмәне (һүрәт 2в). Был биогенездың артыуы йәки бүленештең артыуы менән бәйле булыуы мөмкин; әммә уртаса митохондрия күләменең һиҙелерлек кәмеүе булмағанда, биосинтездың артыуы ихтимал. Әммә 2-се һүрәттәге мәғлүмәттәр ике компенсатор механизмдың барлығын раҫлай: митохондриялар бүленешенең юғарыға көйләүенә тап килгән ваҡиғалар һаны артыуы һәм митохондрия биогенезына тап килгән ваҡиғалар һаны артыуы. Һуңғы сиктә еңелсә көсөргәнеш өсөн динамик компенсация бүленә, синтез, биогенез һәм митофагияны үҙ эсенә алған бер үк ваҡыттағы процестарҙан торорға мөмкин. Алдағы авторҙар күрһәткән булһа ла, ППА митоз30,39 һәм mitophagy29 көсәйтә, беҙ митохондрия бүленә һәм синтез динамикаһы ремоделирование өсөн дәлилдәр килтерә яуап ППА. Был мәғлүмәттәр ТЭМ күҙәтелгән морфологик үҙгәрештәрҙе раҫлай һәм ППА-индуцированный митохондрия дисфункцияһы менән бәйле механизмдарҙы артабан аңлау мөмкинлеген бирә.
Сөнки ТЭМ да, МЭЛ анализы ла күҙәтелгән морфологик үҙгәрештәрҙең нигеҙендә ятҡан гендарҙы көйләү механизмдары тураһында туранан-тура дәлилдәр бирмәне, беҙ митохондрия алмашыныуында, биогенезда һәм динамикала ҡатнашҡан гендар РНК экспрессияһын тикшерҙек. cMYC протоонкогены — митохондриялар, гликолиз, аминокислоталар һәм май кислоталары алмашыныуын көйләүҙә ҡатнашҡан транскрипция факторы40. Бынан тыш, cMYC митохондрия транскрипцияһында, тәржемәһендә һәм ҡатмарлы йыйыуҙа ҡатнашҡан 600-гә яҡын митохондрия генының экспрессияһын көйләүе билдәле, шул иҫәптән NRF1 һәм TFAM41. NRF1 һәм TFAM — митоздың ике үҙәк көйләүсеһе, мтДНК репликацияһын әүҙемләштереү өсөн PGC-1α-нан түбәнерәк эш итә. Был юл цАМФ һәм АМПК сигнал биреүҙең ярҙамында әүҙемләшә һәм энергия сығымдарына һәм матдәләр алмашыныуы стрессына һиҙгер. Беҙ шулай уҡ тикшерҙе NFE2L2, митохондрия биогенезы редокс регуляторы, билдәләү өсөн, эффекты ППА мөмкин медиация окислывающий стресс.
NFE2L2 экспрессияһы үҙгәрешһеҙ ҡалһа ла, беҙ эҙмә-эҙлекле дозаға бәйле кәмеүен таптыҡ экспрессияһы cMYC, NRF1 һәм TFAM 24 сәғәттән һуң 3 мМ һәм 5 мМ ППА менән дауалау (һүрәт. 3а-в). 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып митохондрияның стрессҡа яуап булыуы тураһында хәбәр ителгән, ә киреһенсә, митохондрияның дисфункцияһын митохондрия алмашыныуын, селтәр тоташыуын һәм мембрана поляризацияһын үҙгәртеп ҡороу юлы менән митохондрия дисфункцияһын тыуҙыра ала. Ҡыҙыҡ, cMYC шулай уҡ митохондриялар бүленеш һәм fusion көйләүҙә ҡатнаша42,43 һәм күҙәнәк бүленеш ваҡытында DRP1 фосфорилләшеүен һәм митохондрия локализацияһын арттырыуы билдәле44, шулай уҡ нейрон тамыр күҙәнәктәрендә митохондрия морфологик ремоделләүен медиациялай45. Ысынлап та, cMYC-дефицитлы фибробласттар митохондрия күләменең кәмеүен күрһәтә, PPA43 стресс индуцированный үҙгәрештәргә тап килә. Был мәғлүмәттәр ҡыҙыҡлы, әммә әлегә асыҡ булмаған бәйләнештәрҙе күрһәтә cMYC һәм митохондрия динамикаһы, ҡыҙыҡлы маҡсат булып тора, киләсәктә өйрәнеү өсөн PPA стресс-индуцированный ремоделирование.
NRF1 һәм TFAM-дың кәмеүе cMYC-тың мөһим транскрипция активаторы булараҡ роле менән тап килә. Был мәғлүмәттәр шулай уҡ кешенең ҡалын эсәк яман шеше күҙәнәктәрендә үткәрелгән алдағы тикшеренеүҙәр менән тап килә, улар күрһәтеүенсә, ППА 22 сәғәттә NRF1 мРНК экспрессияһын кәметә, был АТФ-тың кәмеүе һәм ROS46-ның артыуы менән бәйле. Был авторҙар шулай уҡ хәбәр итеүенсә, TFAM экспрессияһы 8,5 сәғәттә арта, әммә 22 сәғәттә башланғыс кимәлгә ҡайта. Уның ҡарауы, Ким һ.б. (2019) күрһәткәнсә, TFAM мРНК экспрессияһы һиҙелерлек кәмегән һуң 4 h ППА стресс SH-SY5Y күҙәнәктәрендә; әммә 72 сәғәттән һуң ТФАМ аҡһымының экспрессияһы һиҙелерлек арта һәм мтДНК күсермәләре һаны һиҙелерлек арта. Шулай итеп, беҙ 24 сәғәттән һуң күҙәткән митохондрия биогенезы гендарының кәмеүе митохондриялар һаны артыуының элекке ваҡыт нөктәләрендә биогенездың әүҙемләшеүе менән бәйле булыуы мөмкинлеген инҡар итмәй. Алдағы тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, ППА 4 сәғәт 39 минутта SH-SY5Y күҙәнәктәрендә ПГК-1α мРНК һәм аҡһымды һиҙелерлек күтәрә, ә пропион кислотаһы 12 сәғәт 39 минутта ПГК-1α аша быҙау гепатоциттарында митохондрия биогенезын көсәйтә. Ҡыҙыҡ, PGC-1α туранан-тура транскрипция регуляторы ғына түгел, NRF1 һәм TFAM, әммә шулай уҡ күрһәтелгән, тип көйләү эшмәкәрлеге MFN2 һәм DRP1 көйләү юлы менән бүленә һәм fusion47. Ҡабул ителгән, был тығыҙ бәйләнеш механизмдарын көйләүсе митохондрия компенсатор яуаптар индуцированный ППА. Өҫтәүенә, беҙҙең мәғлүмәттәр ППА стрессы аҫтында биогенез һәм метаболизмдың транскрипцион көйләүенең әһәмиәтле дисрегуляцияһын сағылдыра.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 һәм DRP1 гендары митохондриялар бүленә, синтез һәм динамиканың үҙәк көйләүселәре иҫәбенә инә. Митохондрия динамикаһында ҡатнашҡан башҡа гендар күп, шулай ҙа, STOML2, OPA1 һәм MFN2 быға тиклем дифференциаль метилланған АСД когортаһында табылған,16 һәм бер нисә бойондороҡһоҙ тикшеренеүҙең үҙгәрештәре тураһында хәбәр итеү был транскрипция факторҙары яуап митохондрия стресс50,5. 52. Экспрессия һәм OPA1 һәм STOML2 һиҙелерлек кәметелгән 3 мМ һәм 5 мМ ППА дауалау (һүрәт. 3е, е). OPA1 - MFN1 һәм 2 менән туранан-тура үҙ-ара тәьҫир итешеү аша митохондриялар синтезының классик көйләүселәренең береһе һәм кристаларҙы үҙгәртеп ҡороуҙа һәм митохондриялар морфологияһында роль уйнай53. STOML2-нең митохондриялар динамикаһында аныҡ роле асыҡланмаған, әммә дәлилдәр уның митохондриялар синтезында, биогенезда һәм митофагияла роль уйнауын күрһәтә.
STOML2 митохондрия тын алыу бәйләнешен һаҡлауҙа һәм тын алыу сылбырҙары комплекстарын барлыҡҡа килтереүҙә ҡатнаша54,55 һәм яман шеш күҙәнәктәренең метаболизм үҙенсәлектәрен тәрән үҙгәртеүе күрһәтелгән56. Тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, STOML2 митохондрия мембранаһы потенциалын һәм биогенезды BAN һәм кардиолипин менән үҙ-ара тәьҫир итешеү аша булышлыҡ итә 55, 57, 58. Өҫтәүенә, бойондороҡһоҙ тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, STOML2 һәм PINK1 араһындағы үҙ-ара тәьҫир итешеү митофагияны көйләй59,60. STOML2 туранан-тура үҙ-ара эш итеү һәм MFN2 тотороҡландырыу тураһында хәбәр ителә, шулай уҡ оҙон OPA1 изоформаларын тотороҡландырыуҙа мөһим роль уйнай, OPA1 деградацияһы өсөн яуаплы протеазаны тормошҡа ашырыу юлы менән53,61,62. STOML2 экспрессияһының кәмеүе күҙәтелгән ППА реакциялары был синтез аҡһымдарҙы убиквитин һәм протеасомаға бәйле юлдар аша деградацияға һиҙгерерәк итә ала48. STOML2 һәм OPA1-ҙең ППА-ға динамик яуап биреүҙең аныҡ роле асыҡланмаһа ла, был синтез гендарының экспрессияһы кәмеүе (3-сө һүрәт) бүленә һәм синтез араһындағы балансты боҙоуы һәм митохондриялар күләменең кәмеүенә килтерергә мөмкин (3-сө һүрәт). 1).
Икенсе яҡтан, OPA1 аҡһым экспрессияһы 24 сәғәттән һуң үҙгәрешһеҙ ҡала, шул уҡ ваҡытта мРНК һәм аҡһым кимәле MFN1, MFN2 йәки DRP1 һиҙелерлек үҙгәрмәй, һуңынан ППА дауалау (һүрәт. 3g-i, һүрәт. 4). Был митохондриялар синтезында һәм бүленешендә ҡатнашҡан был факторҙарҙы көйләүҙә үҙгәрештәр булмауын күрһәтә ала. Әммә шуныһы иғтибарға лайыҡ: был дүрт гендың һәр береһе шулай уҡ аҡһым эшмәкәрлеген контролдә тотҡан посттранскрипцион модификациялар (ПТМ) ярҙамында көйләнә. Һигеҙ альтернатив сплайс варианты бар, улар митохондрияларҙа протеолитически ярыла, ике айырым изоформа етештереү өсөн 63 . Ҡыҫҡа һәм оҙон изоформалар араһындағы баланс, ниһайәт, митохондриялар синтезында һәм митохондриялар селтәрен һаҡлауҙа OPA1 ролен билдәләй64. DRP1 эшмәкәрлеге кальций/кальмодулинға бәйле аҡһым киназа II (CaMKII) фосфорилләшеүе ярҙамында көйләнә, ә DRP1 деградацияһы убиквитинация һәм SUMOylation65 ярҙамында көйләнә. Һуңғыһы, DRP1 һәм MFN1/2 икеһе лә ГТФазалар булып тора, шуға күрә эшмәкәрлеккә митохондрияларҙа ГТФ етештереү тиҙлеге йоғонто яһай ала 66 . Шуға күрә, был аҡһымдар экспрессияһы даими булып ҡалһа ла, был үҙгәрмәгән аҡһым эшмәкәрлеген йәки локализацияһын сағылдырмауы ихтимал67,68. Ысынлап та, ғәмәлдәге ПТМ аҡһым репертуарҙары йыш ҡына киҫкен стресс яуаптарын медиациялау өсөн яуаплы беренсе оборона һыҙығы булып хеҙмәт итә. Беҙҙең модельдә уртаса метаболизм стрессы булғанда, ПТМ был гендарҙы мРНК йәки аҡһым кимәлендә өҫтәмә әүҙемләштереүҙе талап итмәйенсә, митохондрия бөтөнлөгөн етерлек кимәлдә тергеҙеү өсөн синтез һәм бүленеш аҡһымдарының әүҙемлеген арттырыуға булышлыҡ итә, моғайын.
Ҡайһы бер осраҡта был ҡатмарлы һәм ваҡытҡа бәйле митохондрия морфологияһының көйләүен һәм был механизмдарҙы асыҡлау проблемаларын асыҡлай. Гендар экспрессияһын өйрәнеү өсөн тәүҙә юлдағы аныҡ маҡсатлы гендарҙы билдәләргә кәрәк. Әммә беҙҙең мәғлүмәттәр бер үк юлдағы гендар бер үк стрессҡа бер үк рәүештә яуап бирмәүен күрһәтә. Ысынында, алдағы тикшеренеүҙәр күрһәтеүенсә, бер үк юлдағы төрлө гендар төрлө ваҡытлы яуап профилдәрен күрһәтә ала30,46. Бынан тыш, транскрипция һәм ген функцияһы араһындағы бәйләнеште боҙған ҡатмарлы транскрипциянан һуңғы механизмдар бар. Протеомик тикшеренеүҙәр ПТМ-дар һәм аҡһым функцияһының йоғонтоһон аңлау мөмкинлеген бирә ала, әммә улар шулай уҡ түбән үткәреүсәнлекле ысулдар, юғары сигнал-шум нисбәте һәм насар асыҡлыҡты үҙ эсенә алған проблемалар тыуҙыра.
Был контекста ТЭМ һәм МЭЛ ҡулланып митохондрия морфологияһын өйрәнеү митохондрия динамикаһы һәм функцияһы араһындағы бәйләнеш һәм был сиргә нисек йоғонто яһауы тураһында төп һорауҙарҙы хәл итеү өсөн ҙур потенциалға эйә. Иң мөһиме, ТЭМ митохондрия морфологияһын үлсәү өсөн туранан-тура ысул тәьмин итә, митохондрия дисфункцияһы һәм динамикаһының конвергент ос нөктәһе булараҡ51. Өс үлсәмле күҙәнәк мөхитендә бүленә һәм синтез ваҡиғаларын визуалләштереү өсөн туранан-тура ысул тәьмин итә, ген экспрессияһында үҙгәрештәр булмағанда ла динамик митохондриялар ремоделләшеүен һанлаштырыу мөмкинлеген бирә33. Бында беҙ икенсел митохондрия ауырыуҙарында митохондрияларҙы һүрәтләү алымдарының файҙалылығын билдәләйбеҙ. Был ауырыуҙарға, ғәҙәттә, хроник еңел метаболизм стрессы хас, ул митохондрия селтәрҙәренең киҫкен зыяны менән түгел, ә нескә ремоделләшеүе менән билдәләнә. Әммә хроник стресс аҫтында митозды һаҡлау өсөн кәрәкле митохондрия компенсацияһы тәрән функциональ эҙемтәләргә килтерә. Нейрофән контексында был компенсатор механизмдарҙы яҡшыраҡ аңлау митохондрия дисфункцияһы менән бәйле плеотроп нейропатология тураһында мөһим мәғлүмәт бирергә мөмкин.
Һуңғы һөҙөмтәлә, беҙҙең мәғлүмәттәр ген экспрессияһы, аҡһым модификацияһы һәм нейрон митохондрия динамикаһын контролдә тотҡан аҡһым эшмәкәрлеге араһындағы ҡатмарлы үҙ-ара тәьҫир итешеүҙәрҙең функциональ эҙемтәләрен аңлау өсөн һүрәт төшөрөү алымдарының файҙалылығын билдәләй. Беҙ ҡулланған PPA моделләштереү өсөн митохондрия дисфункцияһы нейрон күҙәнәк моделе алыу өсөн төшөнсә митохондрия компоненты АСД. ППА менән эшкәртелгән SH-SY5Y күҙәнәктәре митохондриялар морфологияһында үҙгәрештәр күрһәтә: митохондриялар бәләкәй һәм түңәрәк була, ә ТЭМ менән күҙәткәндә кристалар насар билдәләнә. МЭЛ анализы күрһәтеүенсә, был үҙгәрештәр еңелсә метаболизм стрессына яуап итеп митохондрия селтәрен һаҡлау өсөн бүленә һәм синтез ваҡиғаларының артыуы менән бергә була. Өҫтәүенә, ППА митохондриялар алмашыныуының һәм гомеостазының транскрипцион көйләүен һиҙелерлек боҙа. Беҙ cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, һәм OPA1 төп митохондрия регуляторҙары булараҡ, ППА стресс боҙолған һәм роль уйнай ала медиация ППА-индуцированный үҙгәрештәр митохондрия морфологияһы һәм функцияһы. Киләсәктә тикшеренеүҙең гендар экспрессияһында һәм аҡһым эшмәкәрлегендә, локализацияла һәм трансляциянан һуңғы үҙгәрештәрҙә ППА-индуцированный ваҡыт үҙгәрештәрен яҡшыраҡ характерлау өсөн кәрәк. Беҙҙең мәғлүмәттәр ҡатмарлылыҡты һәм үҙ-ара бәйлелекте билдәләй, митохондрия стресс яуап медиация көйләү механизмдары һәм ТЭМ һәм башҡа ысулдарҙы һүрәтләү өсөн файҙалылығын күрһәтә, күберәк маҡсатлы механистик тикшеренеүҙе.
SH-SY5Y күҙәнәк линияһы (ECACC, 94030304-1ВЛ) «Сигма-Ольдрих» компанияһынан һатып алынған. SH-SY5Y күҙәнәктәре үҫтерелгән Дульбекко үҙгәртелгән бөркөт уртаса/F-12 туҡлыҡлы матдәләр ҡатнашмаһы (DMEM/F-12) һәм L-глутамин (SC09411, ScienCell) 25 см2 колбаларҙа 20% фетал һыйыр ҡан һыуытҡысы (F4BS9mo1) менән тулыландырылған (F4BS9mo1) һәм 1% пенициллин-стрептомицин (Р4333-20МЛ, Сигма-Ольдрих) 37 °C, 5% CO2. Күҙәнәктәрҙе 0,05% трипсин-ЭДТА (15400054), ThermoFisher Scientific ҡулланып 80% конфлюенсҡа тиклем субкультуралайҙар, 300 г центрифугалайҙар һәм яҡынса 7 × 105 күҙәнәк/мл тығыҙлыҡта ҡаплайҙар. 19-22-се үткәүелдәр араһындағы дифференциацияланмаған SH-SY5Y күҙәнәктәрендә бөтә тәжрибәләр ҙә үткәрелгән. ППА NaP рәүешендә индерелә. NaP порошогын (137-40-6 һанлы CAS, химик формулаһы C3H5NaO2, Р5436-100G, Сигма-Ольдрих) йылы MilliQ һыуында 1 М концентрацияға тиклем иретергә һәм 4 °C температурала һаҡларға. Дауалау көнөндә был иретмәне 1 М ППА менән 3 мМ һәм 5 мМ ППА тиклем ҡан һыуытҡысһыҙ мөхиттә (DMEM/F-12 L-глутамин менән) һыуытып алалар. Бөтә тәжрибәләр өсөн дауалау концентрациялары ППА (0 мМ, контроль), 3 мМ һәм 5 мМ ППА булмаған. Тәжрибәләр кәмендә өс биологик ҡабатлауҙа үткәрелгән.
SH-SY5Y күҙәнәктәре 25 см5 колбаларға 5,5 × 105 күҙәнәк/мл тиҙлек менән сәселгән һәм 24 сәғәт үҫтерелгән. ППА эшкәрткән колбаға 24 сәғәт инкубацияға тиклем өҫтәлгән. Йыйыу күҙәнәк гранулалары ғәҙәти һөтимәр туҡыма субкультураһы протоколдары буйынса (өҫтә һүрәтләнгән). 100 мкл 2,5% глутаральдегид, 1× PBS күҙәнәк гранулаһын ресуспендировать һәм эшкәрткәнгә тиклем 4 °C һаҡлай. SH-SY5Y күҙәнәктәре ҡыҫҡа ваҡытҡа центрифугаланған күҙәнәктәрҙе гранулалаштырыу һәм 2,5% глутаральдегид, 1× PBS иретмәһе сығарыу өсөн. Ултырманы дистиллированный һыуҙа әҙерләнгән 4 процентлы агароза гелендә (агарозаның ултырма күләменә нисбәте 1:1) ҡабаттан суспендировать итәләр. Агароза киҫәктәрен яҫы пластиналарҙағы селтәрҙәргә ҡуйып, юғары баҫымда туңдырыу алдынан 1-гексадецен менән ҡаплайҙар. Өлгөләрҙе 100 процентлы ҡоро ацетонда -90°С температурала 24 сәғәт туңдыралар. Артабан температураны -80°С тиклем күтәрәләр һәм 1% осмий тетроксиды һәм 0,1% глутаральдегид иретмәһе өҫтәйҙәр. Өлгөләрҙе -80°С температурала 24 сәғәт һаҡлайҙар. Бынан һуң температураны бер нисә көн дауамында яйлап бүлмә температураһына тиклем күтәрәләр: тәүлек эсендә – 80 °C-тан – 50 °C-ҡа тиклем, тәүлек эсендә – 30 °C-ҡа тиклем, тәүлек эсендә – 10 °C-ҡа тиклем һәм, ниһайәт, бүлмә температураһына тиклем. температура.
Криоген әҙерләгәндән һуң өлгөләр смола менән һеңдерелә һәм Leica Reichert UltracutS ультрамикротомы (Leica Microsystems) ярҙамында ультранәҙек өлөштәр (∼100 нм) эшләнә. 2% уранилацетат һәм ҡурғаш цитраты менән өлөштәр буялған. Өлгөләр 200 кВ-та эшләгән FEI Tecnai 20 тапшырыу электрон микроскобы (ThermoFisher (элекке FEI), Эйндховен, Нидерландтар) һәм Tridiem энергия фильтры менән йыһазландырылған Gatan CCD камераһы (Gatan, Бөйөк Британия) ярҙамында күҙәтелгән.
Һәр техник репликала кәмендә 24 бер күҙәнәкле һүрәт алынған, дөйөм алғанда 266 һүрәт. Бөтә һүрәттәр ҙә ҡыҙыҡһыныу төбәге (ROI) макросы һәм митохондрия макросы ярҙамында анализланды. Митохондрия макросы баҫылған ысулдарға нигеҙләнгән17,31,32 һәм Фиджи/ImageJ69 ТЭМ һүрәттәрен ярымавтоматлаштырылған партиялы эшкәртергә мөмкинлек бирә. Ҡыҫҡаһы: һүрәтте кире ҡайтарыу һәм кире ҡайтарыу ярҙамында роллинг туп фон алыу (60 пиксель радиусы) һәм FFT полоса үткәреү фильтры (яуаплы рәүештә 60 һәм 8 пиксель өҫкө һәм аҫҡы сиктәрен ҡулланып) һәм вертикаль һыҙыҡ баҫтырыу менән ориентация толерантлығы 5%. Эшкәртелгән һүрәт автоматик рәүештә максималь энтропия алгоритмы ярҙамында сикләнә һәм бинар битлек генерациялана. Ҡул менән һайланған ROIs менән бәйле һүрәт төбәктәре сеймал ТЭМ һүрәттәрендә сығарылған, митохондрияларҙы характерлау һәм плазма мембранаһы һәм башҡа юғары контрастлы төбәктәрҙе сығарып ташлау. Һәр сығарылған ROI өсөн 600 пикселдән ҙурыраҡ бинар киҫәксәләр анализланды, ә киҫәксәләр майҙаны, периметры, төп һәм бәләкәй балталары, Ферет диаметры, түңәрәклек һәм түңәрәклек Fiji/ImageJ-тың индерелгән үлсәү функциялары ярҙамында үлсәнде. Меррил, Флиппо һәм Страктан һуң (2017), был мәғлүмәттәрҙән 2-се майҙан, киҫәксәләрҙең формат нисбәте (ҙур һәм бәләкәй күсәр нисбәте), форма факторы (ФФ) иҫәпләнгән, унда ФФ = периметр 2/4pi х майҙан. Параметрик формуланың билдәләмәһен Меррил, Флиппо һәм Страктың (2017) хеҙмәтендә табырға мөмкин. Әйтелгән макростар GitHub-та бар (ҡара: Мәғлүмәттәрҙең булыуы тураһында белдереүҙе). Уртаса алғанда, яҡынса 5,600 киҫәксәләр анализланған бер ППА эшкәрткән, дөйөм алғанда, яҡынса 17,000 киҫәксәләр (мәғлүмәттәр күрһәтелмәгән).
SH-SH5Y күҙәнәктәре 8-камералы культура һауыттарына урынлаштырылған (ТермоФишер, #155411) рөхсәт итеү өсөн адгезия төнө буйы һәм һуңынан TMRE менән инкубировать 1:1000 (ТермоФишер, #T669) һәм Хёхст 33342 1:200 H-200 (СигмаА200). буяу. минутлыҡ мөхиттә 405 нм һәм 561 нм лазерҙар ҡулланып һүрәттәр алынған, ә сеймал һүрәттәре z-стектар рәүешендә алынған, уларҙа 10 һүрәт микрографияһы 0,2 мкм аҙым менән һүрәт кадрҙары араһында 12 артабанғы ваҡыт нөктәһендә . Һүрәттәр Карл Цайс LSM780 ELYRA PS.1 супер-сисеш платформаһы (Карл Цайс, Оберкохен, Германия) ярҙамында LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 объективы ярҙамында йыйылған. Һүрәттәр ImageJ анализланды, алдан һүрәтләнгән торба һәм ImageJ плагин ҡулланып, синтез һәм бүленеш ваҡиғаларын үлсәү өсөн, митохондрия структураларының уртаса һаны, һәм бер күҙәнәккә уртаса митохондрия күләме33. MEL макростары GitHub-та бар (ҡара: Мәғлүмәттәрҙең булыуы тураһында белдереүҙе).
SH-SY5Y күҙәнәктәре алты скважиналы пластинкаларҙа 0,3 × 106 күҙәнәк/мл тығыҙлығында 24 сәғәт дауамында дауалау алдынан үҫтерелгән. РНК экстракцияланған ҡулланыу тиҙ-РНК TM Miniprep протоколы (ZR R1055, Zymo Research) бер аҙ үҙгәрештәр менән: өҫтәргә 300 мкл РНК лизис буферы һәр скважинаға сығарыу алдынан һәм лизис һәр өлгө һуңғы аҙым булараҡ 30 мкл ДНКаза/РНКаза элюцияһы. -бушлай һыу. Бөтә өлгөләр ҙә NanoDrop ND-1000 УФ-Вис спектрофотометры ярҙамында күләме һәм сифаты буйынса тикшерелде. 200 мкл RIPA лизис буферы ярҙамында күҙәнәк лизаттарынан дөйөм аҡһым алынған, ә аҡһым концентрацияһы Брэдфорд аҡһым анализы ярҙамында һанлаштырылған70.
кДНК синтезы етештереүсенең күрһәтмәләре буйынса ҡайһы бер үҙгәрештәр индереп, TetroTM кДНК синтезы комплекты (BIO-65043, Meridian Bioscience) ҡулланып башҡарылған. кДНК 20 мкл реакцияларҙа 0,7-нән 1 мкг дөйөм РНК ҡулланып синтезлана. 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78-се хеҙмәттәрҙән праймерҙар һайлап алынған (S1 таблицаһы) һәм оҙатыусы зондтар Интеграцияланған ДНК технологиялары компанияһының PrimerQuest инструменты ярҙамында эшләнгән. Ҡыҙыҡһындырған бөтә гендар ҙа ядро ​​В2М генына нормалаштырылған. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC һәм OPA1 гендарының экспрессияһы RT-qPCR ысулы менән үлсәнә. LUNA Taq полимеразаһы (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ алға һәм кире праймерҙар, кДНК һәм ПЦР-сортлы һыу инә, һәр реакция өсөн 10 мкл һуңғы күләм ала. Бүленеш һәм бүленеш гендарының (DRP1, MFN1/2) экспрессияһы TaqMan мультиплекс анализдары ярҙамында үлсәнә. Ай универсаль зонд qPCR мастер-микс (M3004S, Яңы Англия Biolabs) етештереүсенең күрһәтмәләре буйынса ваҡ үҙгәрештәр менән ҡулланылған. Мультиплекслы RT-qPCR мастер-микс 1X LUNA Taq полимераза, 10 мкМ алға һәм кире праймерҙар, 10 мкМ зонд, кДНК һәм ПЦР-сортлы һыуҙы үҙ эсенә ала, һөҙөмтәлә һәр реакция өсөн һуңғы күләм 20 мкл тәшкил итә. RT-qPCR ротор-ген Q 6-плексы (QIAGEN RG-серия номеры: R0618110) ҡулланып башҡарылған. Велосипедта йөрөү шарттары S1 таблицаһында күрһәтелгән. Бөтә кДНК өлгөләре өс тапҡыр көсәйтелгән һәм ун тапҡыр һыуытылған серия ҡулланып стандарт ҡойроҡ генерацияланған. Өс тапҡыр өлгөләрҙә цикл сиге стандарт тайпылышы (Ct) >0.5 анализдан сығарылған, мәғлүмәттәрҙең ҡабатланыуын тәьмин итеү өсөн30,72. Сағыштырмаса ген экспрессияһы 2-ΔΔCt79 ысулы менән иҫәпләнгән.
Аҡһым өлгөләре (60 мкг) 2:1 нисбәтендә Laemmli тейәү буферы менән ҡатнаштырылған һәм 12% төҫһөҙ аҡһым гелендә эшләтелгән (Bio-Rad #1610184). Аҡһымдарҙы ПВДФ (поливинилиденфторид) мембранаһына (#170-84156, Био-Рад) Транс-Блот Турбо системаһы (#170-4155, Био-Рад) ярҙамында күсергәндәр. Мембрана блоклана һәм тейешле беренсел антитәнсә (OPA1, MFN1, MFN2, һәм DRP1) менән (1:1000 һыуытылған) 48 сәғәт инкубациялана, унан һуң икенсел антитәнсә (1:10,000) менән 1 сәғәт инкубациялана. Һуңынан мембраналарға асыҡлыҡ көнбайыш ЭКЛ субстраты (#170-5061, Био-Рад) ярҙамында төшөрөлгән һәм Био-Рад ChemiDoc МП системаһы ярҙамында теркәлгән. Вестерн-блот анализы өсөн ImageLab 6.1 версияһы ҡулланылған. Тәүге гель һәм блот күрһәтелгән һүрәттә S1. Антитәнсә тураһында мәғлүмәт S2 таблицаһында бирелгән.
Мәғлүмәттәр йыйылмаһы кәмендә өс бойондороҡһоҙ өлгөләрҙең уртаса һәм стандарт хатаһы уртаса (SEM) булараҡ бирелә. Мәғлүмәттәр йыйылмаһы Гаусс таралыуын һәм тигеҙ стандарт тайпылыштарҙы фаразлағансы һәм анализдарҙы дауам иткәнсе Шапиро-Уилкс тесты ҡулланып (башҡаса күрһәтелмәһә) нормальлыҡҡа тикшерелгән. Бынан тыш, анализлау мәғлүмәттәр йыйылмаһы ҡулланып Фишер МЭЛ ЛСД (р <0,05), бер яҡлы ANOVA (дауалау ҡаршы контроль уртаса), һәм Даннет күп тапҡыр сағыштырыу тесты әһәмиәтен билдәләү өсөн (р <0,05). р ҡиммәттәре графикта * р <0,05, **р <0,01, ***р <0,001, ****р <0,0001 рәүешендә күрһәтелгән. Бөтә статистик анализдар һәм графиктар GraphPad Prism 9.4.0 ҡулланып башҡарылған һәм генерацияланған.
ТЭМ һүрәттәрен анализлау өсөн Фиджи/ImageJ макростары GitHub сайтында асыҡ: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Митохондрия ваҡиғаларын локатор (MEL) макросы GitHub-та асыҡ: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. һәм Виджая А. Митохондриялар: матдәләр алмашыныуын, гомеостазды, стрессты, ҡартайыуҙы һәм эпигенетиканы оҫта көйләүселәр. Индонезия теле. Биомедицина фәндәре. 221—241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шизофренияла күп яҡлы митохондрия дисфункцияһы, I комплекс мөмкин булған патологик маҡсат булараҡ. Шизофрения. ресурсы. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. һәм Бил, М. Ф. Паркинсон ауырыуында митохондрия дисфункцияһы. Й. Нейрохимия. 139, 216—231 (2016).
Шарма В.К., Сингх Т.Г. һәм Мехта В. Стресслы митохондриялар: Альцгеймер ауырыуында инвазия маҡсаттары. Митохондриялар 59, 48—57 (2021).
Беленгер П., Дуарте Дж.М.Н., Шок П.Ф. һәм Феррейра Г.К. Митохондриялар һәм мейе: биоэнергетика һәм башҡалар. Нейротоксиндар. ресурсы. 36, 219—238 (2019).
Рангараджу, В. и др. Плейотроп митохондриялар: митохондриялар нейрондар үҫешенә һәм ауырыуҙарға йоғонтоһо. Й. Нейрофән. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьо-Рамос, С. һәм Мораис, В.А. Нейрондарҙа митохондрия биогенезы: нисек һәм ҡайҙа. халыҡ-аралыҡҡа эйә. Й. Мор. фәнде өйрәнә. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Нистер, М. һәм Чжао, Дж. Һөт имеҙеүселәрҙең митохондрия динамикаһын көйләү: мөмкинлектәр һәм проблемалар. ал. эндокрин. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. һәм Слэк, Р. С. Нейрогенезды көйләүҙә митохондрия динамикаһы: үҫешкән мейенән оло мейегә тиклем. үҫеш. динамик. 247, 47—53 (2018).