Хәҙерге *Ағымдағы адресы: Кельн 50931, Германия, Кельн кластеры тикшеренеүҙең күҙәнәк стресс яуап ҡартайыу менән бәйле ауырыуҙар (CECAD).
Митохондрия ауырыуҙарының нейродегенерацияһы кире ҡайтарып булмаҫлыҡ тип иҫәпләнә, сөнки нейрондар метаболизм пластичлығы сикләнгән, әммә митохондрия дисфункцияһының организмда нейрондар алмашыныуының күҙәнәк автономияһына йоғонтоһо насар аңлашыла. Бында беҙ митохондриялар синтезы динамикаһының боҙолоуы арҡаһында прогрессив OXPHOS етешмәүсәнлеге булған Пуркинже нейрондарының күҙәнәккә хас протеомын индерәбеҙ. Беҙ митохондриялар дисфункцияһы протеомика өлкәһендә тәрән үҙгәрештәр тыуҙырыуын асыҡланыҡ, был, ахыр сиктә, күҙәнәк үлеменә тиклем теүәл метаболизм программаларының эҙмә-эҙлекле әүҙемләшеүенә килтерҙе. Көтөлмәгәнсә, беҙ асыҡ индукция пируват карбоксилаза (PCx) һәм башҡа ҡартайыуға ҡаршы ферменттар, улар ТСА циклы арауыҡтарын тулыландыра. PCx-ты тормошҡа ашырыу окисланыу стресын һәм нейродегенерацияны көсәйткән, был атеросклероздың OXPHOS етешмәгән нейрондарҙа һаҡлаусы тәьҫир итеүен күрһәтә. Терминаль дегенерацияланған нейрондарҙа митохондриялар синтезын тергеҙеү был метаболизм үҙенсәлектәрен тулыһынса кире ҡайтара, шуның менән күҙәнәктәрҙең үлеменә юл ҡуймай. Беҙҙең табыштар митохондрия дисфункцияһына ҡаршы тороусанлыҡ биргән быға тиклем билдәһеҙ юлдарҙы асыҡлай һәм нейродегенерацияны сирҙең һуңғы стадияһында ла кире ҡайтарырға мөмкин икәнлеген күрһәтә.
Нейрондар энергияһы алмашыныуын һаҡлауҙа митохондриялар үҙәк ролен кеше митохондрияһы ауырыуҙары менән бәйле киң неврологик симптомдар менән һыҙыҡ өҫтөнә ала. Был сирҙәрҙең күбеһе митохондрия гендарының экспрессияһын көйләүсе ген мутациялары (1, 2) йәки митохондрия динамикаһы менән бәйле гендарҙы юҡ итеү арҡаһында барлыҡҡа килә, улар митохондрия ДНК-һының (мтДНК) тотороҡлолоғона туранан-тура йоғонто яһай (3, 4). Хайуандар моделдәрендә эшләү күрһәтеүенсә, тирә-яҡ туҡымаларҙағы митохондриялар дисфункцияһына яуап итеп, консерватив метаболизм юлдарын (5—7) әүҙемләштерергә мөмкин, был был ҡатмарлы сирҙәрҙең патогенезын тәрән аңлау өсөн мөһим мәғлүмәт бирә. Ҡаршылыҡлы, беҙҙең аңлау метаболизм үҙгәрештәре аныҡ күҙәнәк типтары сәбәпле дөйөм етешһеҙлектәр мейе митохондрия аденозинтрифосфат (АТФ) етештереү фундаменталь (8), кәрәклеген һыҙыҡ өҫтөнә ала, терапевтик маҡсаттарҙы билдәләү өсөн ҡулланырға мөмкин сирҙәрҙе иҫкәртергә йәки иҫкәртергә. Нейродегенерацияны иҫкәртергә (9). Мәғлүмәт етешмәүе шунда: нервы күҙәнәктәре тирә-яҡ туҡымалар күҙәнәк төрҙәре менән сағыштырғанда бик сикләнгән метаболизм һығылмалылығына эйә тип иҫәпләнә (10). Был күҙәнәктәрҙең нейрондарға метаболиттар менән тәьмин итеүҙе координациялауҙа үҙәк роль уйнауын иҫәпкә алып, синаптик тапшырыуҙы булышлыҡ итеү һәм йәрәхәтләнгән һәм ауырыу шарттарына яуап биргән, күҙәнәк алмашыныуын мейе туҡымаһының ауыр шарттарына яраҡлаштырыу һәләте глиаль күҙәнәктәр менән генә сикләнә тиерлек (11-14). Бынан тыш, мейе туҡымаһының күҙәнәк гетерогенлығы махсус нейрон подгруппаларында барған метаболизм үҙгәрештәрен өйрәнеүгә күп осраҡта ҡамасаулай. Һөҙөмтәлә нейрондарҙа митохондрия дисфункцияһының күҙәнәк һәм метаболизм эҙемтәләре тураһында аныҡ мәғлүмәт аҙ.
Митохондрия дисфункцияһының метаболизм эҙемтәләрен аңлау өсөн беҙ митохондрия тышҡы мембранаһы синтезының (Mfn2) юҡ ителеүе арҡаһында барлыҡҡа килгән нейродегенерацияның төрлө этаптарында Пуркинже нейрондарын (ПН) айырып алдыҡ. Кешеләрҙә Mfn2 мутациялары 2А тибы Шарко-Мари-Тут тип аталған нәҫелдән килгән мотор сенсор нейропатияһының формаһы менән бәйле булһа ла (15), сысҡандарҙа Mfn2-ның шартлы юҡ итеүе окисланыу фосфорилләшеүе (OXthoPHOS) дисфункцияһының яҡшы танылған индукцияһы булып тора. Төрлө нейрон субтиптары (16-19) һәм һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән нейродегенератив фенотип прогрессив неврологик симптомдар менән оҙатыла, мәҫәлән, хәрәкәт боҙолоу (18, 19) йәки баш мейеһе атаксияһы (16). Ҡулланыу комбинацияһы ярлыҡһыҙ миҡдарлы (LFQ) протеомика, метаболомика, образдар, һәм вирусологик ысулдар, беҙ күрһәтәбеҙ, прогрессив нейродегенерация ныҡ индуцировать пируват карбоксилаза (PCx) һәм башҡа факторҙар ҡатнашҡан артериосклероз PNs in vivo Ферменттар экспрессияһы. Был табыштың актуаллеген раҫлау өсөн, беҙ махсус рәүештә Mfn2-дефицитлы PNs PCx экспрессияһын түбәнгә көйләйбеҙ һәм был операцияның окислывающий стрессты көсәйткәнен һәм нейродегенерацияны тиҙләтә икәнлеген асыҡланыҡ, шулай итеп, азооспермияның күҙәнәк үлеменә эйә булыуын иҫбатланыҡ. Ҡаты экспрессия MFN2 тулыһынса ҡотҡара ала терминаль дегенерация PN менән ауыр OXPHOS етешмәүсәнлеге, массив ҡулланыу митохондрия ДНК, һәм, күрәһең, өҙөлгән митохондрия селтәре, был артабан һыҙыҡ өҫтөнә ала, был форма нейродегенерация хатта күҙәнәк сирҙәренең алға киткән стадияһында һауыға ала.
Mfn2 нокаут PNs митохондрияларҙы визуализациялау маҡсатында, беҙ сысҡан штаммын ҡулландыҡ, был Cre-зависимый митохондриялар маҡсатлы һары флуоресцентный аҡһым (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессияһын тикшерҙе һәм митохондрия морфологияһын тикшерҙе in vivo. Беҙ асыҡланыҡ, тип юҡ итеү Mfn2 ген PNs яйлап бүленеш митохондрия селтәре килтерәсәк (һүрәт S1A), һәм иң тәүге үҙгәреш 3 аҙналыҡ йәшендә табылған. Ә бына ПН күҙәнәк ҡатламының һиҙелерлек дегенерацияһы, был Кальбиндин иммуноокрашиваниеһының юғалыуы менән дәлилләнә, 12 аҙналыҡҡа тиклем башланмай (1-се һүрәт, А һәм В). Митохондрия морфологияһындағы иң тәүге үҙгәрештәр һәм нейрондар үлеменең күренеп торған башланыуы араһындағы ваҡыт тап килмәүе күҙәнәк үлеменә тиклем митохондрия дисфункцияһы арҡаһында барлыҡҡа килгән метаболизм үҙгәрештәрен тикшерергә этәрҙе. Беҙ эшләгән флуоресценция-әүҙемләштерелгән күҙәнәк сортлау (FACS)-нигеҙендә стратегияһы изоляциялау өсөн YFP (YFP +)-экспрессирующий PN (һүрәт 1С), һәм контроль сысҡандар (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- туҡтау-loxP: : L7-cre), артабан CT1BRL тип атала (һүрәт). Ҡапҡа стратегияһын оптимизациялау нигеҙендә сағыштырмаса интенсивлығы YFP сигналы беҙгә таҙартыу мөмкинлеге бирә YFP + тән (YFPhigh) PNs PNs булмаған (YFPneg) (һүрәт S1B) йәки фаразланған флуоресцентный аксон/дендрит фрагменттары (YFPo; һүрәт S1D confirmed, һул). Классификацияланған популяцияның үҙенсәлеген раҫлау маҡсатында беҙ LFQ протеомикаһын, һуңынан төп компоненттарҙы анализлауҙы үткәрҙек һәм YFPhigh һәм YFPneg күҙәнәктәре араһында асыҡ айырыу барлығын асыҡланыҡ (S1C һүрәте). YFPhigh күҙәнәктәр күрһәткән таҙа байытыу билдәле PNs маркерҙары (йәғни Calb1, Pcp2, Grid2 һәм Itpr3) (21, 22), әммә нейрондарҙа йәки башҡа күҙәнәк типтары йыш ҡына аҡһымдарҙы байытыу юҡ (һүрәт 1D) ). Бойондороҡһоҙ тәжрибәләрҙә йыйылған классификацияланған YFPhigh күҙәнәктәрендәге өлгөләрҙе сағыштырыу корреляция коэффициентын күрһәтте> 0,9, биологик репликалар араһында яҡшы ҡабатланыусанлыҡты күрһәтә (S1E һүрәте). Йәмғеһе, был мәғлүмәттәр беҙҙең планды раҫланы киҫкен һәм аныҡ изоляциялау өсөн ғәмәлгә ашырырлыҡ ПН. Сөнки L7-cre драйвер системаһы ҡулланылған индуцировать мозаика рекомбинацияһы тапшырғандан һуң тәүге аҙнала (23), беҙ сысҡандарҙы CTRL һәм шартлы (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейрондар йыйыу башланы. Рекомбинация тамамланғас, 4 аҙналыҡ сағында Mfn2cKO тип атала. Аҙаҡҡы нөктә булараҡ, беҙ һайланыҡ 8 аҙна йәш ҡасан PN ҡатламы асыҡ митохондрия фрагментацияһына ҡарамаҫтан, бөтөн булды (һүрәт 1В һәм һүрәт S1A). Дөйөм алғанда, беҙ дөйөм 3013 аҡһым һанлы, улар араһында яҡынса 22% нигеҙләнгән MitoCarta 2.0 аннотациялар нигеҙендә митохондрия протеомы митохондрия (һүрәт 1Е) (һүрәт 1Е) (24). 8-се аҙнала үткәрелгән дифференциаль ген экспрессияһы анализы күрһәтеүенсә, бөтә аҡһымдарҙан ни бары 10,5% һиҙелерлек үҙгәрештәр булған (1F һәм S1F һүрәттәре), уларҙан 195 аҡһым түбәнгә көйләнгән, 120 аҡһым өҫкә көйләнгән (1F һүрәте). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: был мәғлүмәттәр йыйылмаһының “инновацион юл анализы” дифференциаль экспрессияланған гендар башлыса махсус метаболизм юлдарының сикләнгән йыйылмаһына ҡарауын күрһәтә (1-се һүрәт Г). Ҡыҙыҡ, әммә юлдарҙы түбәнгә көйләү менән бәйле OXPHOS һәм кальций сигнал биреүҙе раҫлай индукция митохондрия дисфункцияһы синтез-дефицитлы PNs, башҡа категориялар, башлыса аминокислоталар алмашыныуын йәлеп итеү һиҙелерлек upregulated, был метаболизм менән тура килә, тип митохрион conwiring PN. дисфункцияһы.
(А) CTRL һәм Mfn2cKO сысҡандарының мейе өлөштәренең вәкиллекле конфокаль фотоһүрәттәре PNs прогрессив юғалтыуын күрһәтә (калбиндин, һоро); ядролары ДАПИ менән контрабуяланған. (Б) Квантификациялау (А) (бер яҡлы дисперсия анализы, ***Р<0.001; n = 4 6 түңәрәктәр өс сысҡан). (С) Эксперименталь эш ағымы. (D) Йылылыҡ картаһы таралыу маркерҙар үҙенсәлекле Пуркинье (өҫкө) һәм башҡа күҙәнәк типтары (урта). (Е) Венн диаграммаһы күрһәтеү һаны митохондрия аҡһымдар билдәләнгән классификацияланған ПН. (F) Вулкан графигы дифференциаль экспрессияланған аҡһымдар Mfn2cKO нейрондарында 8 аҙна (әһәмиәтлелек ҡырҡыу ҡиммәте 1.3). (G) ижад юл анализы күрһәтә, биш иң мөһим өҫкә-көйләү (ҡыҙыл) һәм аҫҡа-көйләү (күк) юлдар Mfn2cKO PN классификацияланған 8 аҙна. Һәр асыҡланған аҡһымдың уртаса экспрессия кимәле күрһәтелә. Һоро төҫтәге йылылыҡ картаһы: көйләнгән Р ҡиммәте. нс, мөһим түгел.
Протеомика мәғлүмәттәре I, III һәм IV комплекстарының аҡһым экспрессияһы яйлап кәмеүен күрһәткән. I, III һәм IV комплекстарҙа барыһы ла мтДНК-кодланған мөһим субъединицаларҙы үҙ эсенә ала, ә ядро ​​кодланған ғына булған II комплекс, нигеҙҙә, йоғонто яһамай (2А һүрәте һәм S2А һүрәте). . Протеомика һөҙөмтәләренә ярашлы, иммуногистохимия мейе туҡымаһы өлөштәрен күрһәткәнсә, MTCO1 (митохондрия цитохром С оксидазаһы субъединицаһы 1) субъединицаһы кимәле IV комплексы ПН яйлап кәмей (һүрәт 2В). мтДНК-кодлы субъединица Mtatp8 һиҙелерлек кәметелгән (һүрәт S2A), шул уҡ ваҡытта стабиль кимәлдә ядро-кодлы АТФ синтаза субъединицаһы үҙгәрешһеҙ ҡалды, был билдәле тотороҡло АТФ синтаза подсборкаһы F1 комплексы менән тура килә, ҡасан мтДНК экспрессияһы тотороҡло. Формация эҙмә-эҙлекле. Өҙөп (7). Сортланған Mfn2cKO PN-дарҙа мтДНК кимәлен реаль ваҡыттағы полимераз сылбырлы реакция (qPCR) ярҙамында баһалау мтДНК күсермәләре һаны яйлап кәмеүен раҫланы. Контроль төркөм менән сағыштырғанда, 8 аҙна йәшендә, ни бары яҡынса 20% мтДНК кимәле һаҡланған (һүрәт 2С). Был һөҙөмтәләргә ярашлы, конфокаль микроскопия буяу Mfn2cKO PNs ДНК-ны асыҡлау өсөн ҡулланылған, митохондрия нуклеотидтарының ваҡытҡа бәйле ҡулланыуын күрһәтә (2D һүрәте). Беҙ асыҡланыҡ, тип тик ҡайһы бер кандидаттар ҡатнашҡан митохондрия аҡһым деградацияһы һәм стресс яуап өҫкә-көйләнгән, шул иҫәптән Lonp1, Afg3l2 һәм Clpx, һәм OXPHOS комплекслы йыйыу факторҙары. Апоптозда ҡатнашҡан аҡһымдар кимәлендә һиҙелерлек үҙгәрештәр асыҡланмаған (S2B һүрәте). Шулай уҡ, беҙ асыҡланыҡ, митохондрия һәм эндоплазматик селтәр каналдары ҡатнашҡан кальций транспортында тик ваҡ үҙгәрештәр бар (һүрәт S2C). Бынан тыш, аутофагия менән бәйле аҡһымдарҙы баһалау һиҙелерлек үҙгәрештәр тапманы, был иммуногистохимия һәм электрон микроскопияһы ярҙамында in vivo күҙәтелгән аутофагосомаларҙы күренеп индукциялау менән тап килә (S3 һүрәте). Әммә ПН-дарҙа прогрессив ОКСФОС дисфункцияһы асыҡ ультраструктур митохондрия үҙгәрештәре менән оҙатыла. һәм 8 аҙналыҡ Mfn2cKO ПН-дарының күҙәнәк тәндәрендә һәм дендрит ағастарында митохондрия кластерҙарын күрергә мөмкин, эске мембрана структураһы тәрән үҙгәрештәр кисергән (S4, А һәм В һүрәттәре). Был ультраструктур үҙгәрештәргә һәм мтДНК-ның һиҙелерлек кәмеүенә ярашлы, тетраметилродамин метил эфиры менән киҫкен мейе мейеһе киҫәктәрен анализлау (ТМРМ) күрһәткәнсә, Mfn2cKO PNs-та митохондрия мембранаһы потенциалы һиҙелерлек кәмегән (S4C һүрәте).
(А) Ваҡыт анализы экспрессия кимәле OXPHOS комплексы. аҙнала Р<0,05 булған аҡһымдарҙы ғына ҡарарға (ике яҡлы ANOVA). Нөктәле һыҙыҡ: CTRL менән сағыштырғанда көйләү юҡ. (B) Һул: миҫал мейе бүлеге менән билдәләнгән анти-MTCO1 антитән (масштаб бар, 20 мкм). Пуркинже күҙәнәк тәндәре биләгән майҙан һары төҫ менән ҡапланған. Уңда: MTCO1 кимәлен миҡдар буйынса билдәләү (дисперсияның бер яҡлы анализы; n = 7-нән 20-гә тиклем күҙәнәк өс сысҡандан анализланған). (С) qPCR анализ мтДНК күсермәһе һаны сорттарға PN (бер яҡлы анализ дисперсия; n = 3 7 сысҡан). (D) Һул: миҫал мейе киҫәге менән билдәләнгән анти-ДНК антитело (масштаб бар, 20 мкм). Пуркинже күҙәнәк тәндәре биләгән майҙан һары төҫ менән ҡапланған. Уңда: мтДНК лезияларының миҡдарын билдәләү (дисперсияның бер яҡлы анализы; өс сысҡандан n = 5-тән 9 күҙәнәккә тиклем). (Е) Миҫал киҫкен мейе бүлеге күрһәтеү mitoYFP + Purkinje күҙәнәктәре (уҡ) бөтә күҙәнәк патч зажим яҙма. (F) IV ҡойроҡтоң миҡдарын билдәләү. (G) CTRL һәм Mfn2cKO Пуркинье күҙәнәктәрендә деполяризациялаусы ток инъекцияһының вәкиллекле яҙмалары. Өҫкө эҙ: АП-ны тыуҙырған беренсе импульс. Аҫҡы эҙ: Максималь АП йышлығы. (H) Постсинаптик стихиялы инеүҙәрҙең (sPSPs) миҡдарын билдәләү. Вәкиллекле яҙма эҙ һәм уның масштаблау нисбәте (I) күрһәтелгән. Дисперсияның бер яҡлы анализы өс сысҡандан n = 5-тән 20-гә тиклем күҙәнәкте анализланы. Мәғлүмәттәр уртаса±SEM тип бирелә; *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001. (J) вәкиллекле эҙҙәре стихиялы АП теркәлгән ҡулланыу перфорированный патч зажим режимы. Өҫкө эҙ: Максималь АП йышлығы. Аҫҡы эҙ: бер АП-ның масштаблауы. (К) (J) буйынса уртаса һәм максималь АП йышлығын һанлаштырығыҙ. Манн-Уитни тесты; n = 5 күҙәнәк дүрт сысҡандан анализланған. Мәғлүмәттәр уртаса±SEM тип бирелә; мөһим түгел.
аҙналыҡ Mfn2cKO PN-да асыҡ OXPHOS зыяны асыҡланған, был нейрондар физиологик функцияһының ҡаты аномалиялы булыуын күрһәтә. Шуға күрә, беҙ анализлау пассив электр үҙенсәлектәре OXPHOS-дефицит нейрондар 4 5 аҙна һәм 7 8 аҙна башҡарыу аша бөтә күҙәнәк патч зажим яҙмалар киҫкен мейе киҫәктәре (һүрәт 2Е). Көтөлмәгәнсә, уртаса ял мембрана потенциалы һәм инеү ҡаршылығы Mfn2cKO нейрондар контроль оҡшаш булды, әммә күҙәнәктәр араһында нескә айырмалар булды (таблица 1). Шулай уҡ 4-тән 5 аҙнаға тиклем ток-көсөргәнеш бәйләнешендә (IV ҡойроҡ) һиҙелерлек үҙгәрештәр табылмаған (2F һүрәте). Әммә 7-нән 8 аҙналыҡ Mfn2cKO нейрондарының береһе лә IV режимда (гиперполяризация аҙымы) иҫән ҡалмаған, был һуңғы этапта гиперполяризация потенциалына асыҡ һиҙгерлек барлығын күрһәтә. Уның ҡарауы, Mfn2cKO нейрондарында ҡабатланған ғәмәл потенциалы (АП) разрядтарын сәбәпсе булған деполяризациялаусы токтар яҡшы үткәрелә, был уларҙы дөйөм разряд ҡалыптары 8 аҙналыҡ контроль нейрондарҙан һиҙелерлек айырылмауын күрһәтә (1-се таблица һәм 2G һүрәте). Шулай уҡ, йышлығы һәм амплитудаһы стихиялы постсинаптик токтар (sPSCs) контроль төркөмө менән сағыштырырлыҡ булды, һәм ваҡиғалар йышлығы 4 аҙнанан 5 аҙнаға тиклем 7 аҙнанан 8 аҙнаға тиклем оҡшаш артыу менән артты (2-се һүрәт, Н һәм I). ПН-дарҙа синаптик өлгөрөү осоро (25). Оҡшаш һөҙөмтәләр перфорацияланған ПНС патчтарынан һуң да алынған. Был конфигурация күҙәнәкле АТФ дефекттарын мөмкин булған компенсацияға ҡамасаулай, сөнки бөтә күҙәнәкле патч-клем яҙмаһында булыуы мөмкин. Атап әйткәндә, ял мембрана потенциалы һәм Mfn2cKO нейрондарының үҙ-үҙенән атыу йышлығы йоғонто яһамаған (2-се һүрәт, J һәм K). Йәмғеһе, был һөҙөмтәләр асыҡ OXPHOS дисфункцияһы булған ПН-дар юғары йышлыҡтағы разряд ҡалыптарын яҡшы еңә алыуын күрһәтә, был уларҙы нормаға яҡын электрофизиологик яуаптарҙы һаҡларға мөмкинлек биргән компенсация механизмы барлығын күрһәтә.
Мәғлүмәттәр уртаса ± SEM (дисперсияның бер яҡлы анализы, Холм-Сидактың күп тапҡыр сағыштырыу тесты; *Р<0,05) тип бирелә. Берәмек номеры йәйәләр менән күрһәтелгән.
Беҙ тикшерергә ниәтләне, ниндәй ҙә булһа категория протеомика мәғлүмәттәр йыйылмаһында (һүрәт 1G) юлдарҙы үҙ эсенә ала, улар ҡаты OXPHOS етешһеҙлегенә ҡаршы тора ала, шуның менән аңлата, ни өсөн ҡағылған PN һаҡлай ала яҡын-нормаль электрофизиология (һүрәт 2, Е К). . Протеомика анализы күрһәтеүенсә, ферменттар катаболизмында ҡатнашҡан тармаҡлы сылбырлы аминокислоталар (BCAA) һиҙелерлек өҫкә-көйләнгән (һүрәт 3А һәм һүрәт S5A), һәм һуңғы продукт ацетил-КоА (КоА) йәки сукцинил КоА тулыландыра ала трикарбоксилаттар актериосклероз (артериосклероз). Беҙ асыҡланыҡ, тип составы BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) һәм BCAT2 икеһе лә артты. Улар α-кетоглутараттан глутамат генерациялау юлы менән BCAA катаболизмының тәүге аҙымын катализлай (26). Тармаҡлы сылбырлы кетокислота дегидрогеназаһы (BCKD) комплексын тәшкил иткән бөтә субъединицалар ҙа юғарыға көйләнә (комплекс һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән BCAA углерод скелетының артабанғы һәм кире ҡайтарып булмаҫлыҡ декарбоксилләшеүен катализлай) (3А һүрәте һәм S5А һүрәте). Әммә BCAA үҙендә асыҡ үҙгәрештәр табылмаған сорттарға бүленгән PN, был был мөһим аминокислоталарҙы күҙәнәктәрҙә үҙләштереүҙең артыуы йәки башҡа сығанаҡтар ҡулланыу (глюкоза йәки һөт кислотаһы) ТСА циклын тулыландырыу өсөн булыуы мөмкин (һүрәт S5B). PNs етешмәй OXPHOS шулай уҡ 8 аҙна йәшендә глутамин тарҡалыу һәм трансаминация эшмәкәрлеге артыуын күрһәтте, был митохондрия ферменттары глутаминаза (GLS) һәм глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) өҫкә көйләү аша сағылдырыла ала (3-сө һүрәт, А һәм С). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: өҫкә көйләү GLS сикләнгән сплайс изоформа глутаминаза С (GLS-GAC) (үҙгәреш Mfn2cKO/CTRL яҡынса 4,5 тапҡыр, Р = 0,05), һәм уның махсус өҫкә көйләү яман шеш туҡымаларында ярҙам итә ала митонергиондрия. (27).
(А) Йылылыҡ картаһы күрһәтә ҡат үҙгәрештәр аҡһым кимәле өсөн күрһәтелгән маршрут 8 аҙна. (Б) Миҫал өсөн анти-PCx антитән менән маркировкаланған мейе киҫәге (масштаб бар, 20 мкм). Һары уҡ Пуркинье күҙәнәк тәненә күрһәтә. (С) Ваҡыт үткәне аҡһым экспрессияһы анализы мөһим кандидат булараҡ билдәләнгән атеросклероз (күп t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 сысҡан). (D) өҫтә: Схематик схема күрһәтеү, төрлө ысулдар менән инеү маркировкаланған углерод составында [1-13C]пируват следопыт (йәғни, аша PDH йәки транс-артериаль юл). Аҫҡы: Скрипка диаграммаһында күрһәтелгән процент бер маркировкалы углерод (М1) үҙгәртелә аспартат кислотаһы, лимон кислотаһы һәм алма кислотаһы һуң маркировка киҫкен мейе киҫәктәре менән [1-13С]пируват (парлы t-тест; ** Р <0.01). (Е) Күрһәтелгән юлдың ваҡыт тарихын комплекслы анализлау. аҙнала Р<0,05 менән аҡһымдарҙы ғына ҡарарға. Һыҙыҡлы һыҙыҡ: көйләү ҡиммәте юҡ (дисперсияның ике яҡлы анализы; * Р <0,05; *** Р <0,001). Мәғлүмәттәр уртаса±SEM тип бирелә.
Беҙҙең анализ, BCAA катаболизм төп өҫкә көйләү юлдарының береһенә әйләнде. Был факт ныҡлы рәүештә ТСА циклына ингән вентиляция күләменең ОКСФОС булмаған ПН-да үҙгәрергә мөмкинлеген күрһәтә. Был нейрондар метаболизмының төп формаһын күрһәтә ала, был нейрондар физиологияһына һәм ауыр OXPHOS дисфункцияһын һаҡлау ваҡытында йәшәүгә туранан-тура йоғонто яһай ала. Был гипотезаға ярашлы, беҙ асыҡланыҡ, тип төп анти-атеросклеротик фермент PCx өҫкә-көйләнә (Mfn2cKO/CTRL үҙгәрештәр яҡынса 1,5 тапҡыр; һүрәт 3А), был катализаторҙар үҙгәртеп ҡороу пируват оксалоацетат (28), был тип иҫәпләнә, тиссуцита а9000. 30). Протеомика һөҙөмтәләренә ярашлы, конфокаль микроскопия күрһәтеүенсә, PCx экспрессияһы OXPHOS-дефицитлы PNs махсус һәм һиҙелерлек артҡан, шул уҡ ваҡытта PCx реактивлығы башлыса контроль эргәләге Бергман глиаль күҙәнәктәре менән сикләнгән (3-сө һүрәт В). Функциональ тикшерергә күҙәтелгән upregulation PCx, беҙ киҫкен мейе киҫәктәре менән эшкәртелгән [1-13С] пируват следопыт. Ҡасан пируват пируват дегидрогеназа окисланған (ПДГ), уның изотоп ярлығы юғалды , Әммә ТСА циклы аралашсылар индерелә, ҡасан пируват ҡан тамырҙары реакциялары аша метаболизироваться (һүрәт 3D). Беҙҙең протеомика мәғлүмәттәрен хуплап, беҙ был эҙләүсенән күп һанлы маркерҙарҙы Mfn2cKO киҫәктәренең аспартат кислотаһында күҙәттек, шул уҡ ваҡытта лимон кислотаһы һәм алма кислотаһы ла уртаса тенденцияға эйә булды, әммә әһәмиәтле түгел (3D һүрәте).
Дофамин нейрондарында MitoPark сысҡандар менән митохондрия дисфункцияһы сәбәпле дофамин нейрондары махсус рәүештә юҡ итеү митохондрия транскрипция факторы А гены (Tfam) (һүрәт S6B), PCx экспрессияһы шулай уҡ һиҙелерлек өҫкә-көйләнгән (31), күрһәтеүенсә, ацетон кислотаһы дисфункцияһы дисфункцияһы булып тора. ОКСФОС организмда. Шуныһы иғтибарға лайыҡ: был асыҡланған, уникаль ферменттар (32-34), нейрондарҙа экспрессироваться мөмкин, улар менән бәйле булыуы мөмкин артериосклероз һиҙелерлек өҫкә-регулируемый PNs етешмәй OXPHOS, мәҫәлән, пропионил-КоА карбоксилаза (ПКК-А), Малонил-КоА митрионал-пропионилКоА үҙгәртә to ферменты 3 (МЭ3), уның төп роле малаттан пируватты тергеҙеү (3-сө һүрәт, А һәм С) (33, 35). Бынан тыш, беҙ һиҙелерлек артыуын тапты Pdk3 фермент, был фосфорилировать һәм шулай итеп инактивировать PDH (36), шул уҡ ваҡытта үҙгәрештәр асыҡланмаған Pdp1 фермент, активлаштырыу PDH йәки PDH фермент комплексы үҙе (һүрәт 3А). Эҙмә-эҙлекле, Mern2cKO PNs, фосфорилирование α1 субъединица α (PDHE1α) субъединица пируват дегидрогеназа Е1 компоненты PDH комплексы Ser293 (билдәле фермент эшмәкәрлеген тормошҡа ашырыу өсөн PDH) көсәйтелгән ( һүрәт S6C) (һүрәт S6C). Пируваттың ҡан тамырҙары аша үтеүе юҡ.
Ниһайәт, беҙ асыҡланыҡ, тип супер юл серин һәм глицин биосинтезы, бәйле митохондрия фолат (1С) циклы һәм пролин биосинтезы (һүрәт 1G һәм һүрәт S5C) бөтәһе лә һиҙелерлек өҫкә-көйләнә, отчеттар буйынса, әүҙемләштереү процесы барышында. Тирә-яҡ туҡымалар митохондрия дисфункцияһы менән әүҙемләшә (5-7). Был протеомик мәғлүмәттәрҙе раҫлаусы конфокаль анализ күрһәтеүенсә, OXPHOS булмаған ПН-да 8 аҙналыҡ сысҡандарҙағы мейе киҫәктәре митохондрия фолат циклының төп ферменты серин гидроксиметилтрансферазаһы 2 (SHMT2) менән дусар ителә. Һис шикһеҙ, иммун яуап (һүрәт S5D). CU-глюкоза-инкубировать киҫкен мейе киҫәктәре, метаболизм эҙләү тәжрибәләре артабан раҫланы өҫкә-регулирование серин һәм пролин биосинтезы, күрһәтә, тип ағым углерод изоформалары серин һәм пролин артты (һүрәт S5E). Сөнки реакциялар ярҙамында GLS һәм GPT2 синтезы өсөн яуаплы глутамат глутамин һәм трансаминация араһында глутамат һәм α-кетоглутарат, уларҙы upregulation күрһәтә, тип OXPHOS-дефицит нейрондар өсөн ихтыяж артты глутамат , Был йүнәлтелгән булыуы мөмкин һаҡлау өсөн арттырылған proureline biosynthesis (Fig5). Был үҙгәрештәрҙән айырмалы рәүештә, протеомик анализ мейе астроциттары PN-специфик Mfn2cKO сысҡандар күрһәткәнсә, был юлдар (шул иҫәптән бөтә антипероксидазалар) экспрессияла һиҙелерлек үҙгәрмәй, шулай итеп күрһәтеү Был метаболизм перенаправление һайлап алыу өсөн деградацияланған PN (һүрәт. S6).
Йәмғеһе, был анализдар ПН-дарҙа махсус метаболизм юлдарының ваҡытлыса әүҙемләшеүенең һиҙелерлек төрлө ҡалыптарын асыҡланы. Ҡайһы бер нейрондар митохондрияһының аномаль функцияһы атеросклерозға һәм 1С ремоделләшеүенә килтерергә мөмкин булһа ла (3Е һәм S5С һүрәттәре), хатта I һәм IV комплекстар экспрессияһында күҙаллана торған үҙгәрештәр булһа ла, серин де ново синтезындағы үҙгәрештәр генә Ул һуңғы стагеста ғына күренде. OXPHOS дисфункцияһы (3Е һүрәте һәм S5C һүрәте). Был табыштар эҙмә-эҙлекле процесты билдәләй, унда стресс индуцированный митохондрия (1С циклы) һәм цитоплазма (серин биосинтезы) нейрондар алмашыныуын үҙгәртеп ҡороу өсөн ТСА циклында атеросклероздың артыуы менән синергик яуап бирә.
аҙналыҡ OXPHOS-дефицитлы ПН-дар юғары йышлыҡтағы ҡуҙғытыу эшмәкәрлеген һаҡлай ала һәм митохондрия дисфункцияһын компенсациялау өсөн әһәмиәтле метаболизм ҡабаттан тоташтырыу кисерә. Был асыш ҡыҙыҡлы мөмкинлек тыуҙыра, хатта был мәлдә, был күҙәнәктәр ҙә нейродегенерацияны тотҡарлау йәки иҫкәртергә дауалау ярҙамы ала ала. Һуң. Беҙ был мөмкинлекте ике бойондороҡһоҙ ҡыҫылыу аша хәл иттек. Беренсе ысулда, беҙ Cre-зависимый адено-ассоциированный вирус (AAV) векторы эшләгән, шулай итеп, MFN2 һайлап алыу мөмкин OXPHOS-дефицитлы PNs in vivo (һүрәт S7A). ААВ кодлау MFN2 һәм флуоресцентный репортер ген mCherry (Mfn2-AAV) тикшерелгән беренсел нейрон культураларында in vitro, был сәбәпсе булды MFN2 Cre-зависимый ысул менән экспрессироваться һәм митохондрия морфологияһын ҡотҡарҙы, шуның менән нейромутацияны иҫкәртергә Mfns, B Figure S7). Артабан, беҙ үткәргән in vivo тәжрибәләр стереотактик тапшырыу өсөн 8-аҙналыҡ Mfn2-AAV мейе ҡабығы Mfn2cKO һәм контроль сысҡандар, һәм анализлау 12-аҙналыҡ сысҡандар (һүрәт 4А). Эшкәртелгән Mfn2cKO сысҡандар үлгән (1-се һүрәт, А һәм В) (16). Вирус трансдукцияһы in vivo һөҙөмтәһендә һайлап алыу экспрессияһы PN ҡайһы бер мейе түңәрәктәрендә (һүрәт S7, G һәм H). mCherry (Ctrl-AAV) ғына экспресслаусы контроль ААВ инъекцияһы Mfn2cKO хайуандарында нейродегенерация дәрәжәһенә һиҙелерлек йоғонто яһамаған. Уның ҡарауы, анализ Mfn2cKOs трансдуцированный менән Mfn2-AAV күрһәткән әһәмиәтле һаҡлау эффекты PN күҙәнәк ҡатламы (һүрәт 4, В һәм С). Атап әйткәндә, нейрондар тығыҙлығы контроль хайуандарҙан айырылғыһыҙ тиерлек кеүек (4-се һүрәт, В һәм С, S7, Н һәм I һүрәттәре). MFN1 экспрессияһы, әммә MFN2 түгел, нейрон үлем ҡотҡарыуҙа берҙәй һөҙөмтәле (һүрәт 4С һәм һүрәт S7, C һәм F), был күрһәтә, тип эктопик MFN1 экспрессияһы һөҙөмтәле тулыландыра ала етешмәүе MFN2. Артабан анализ берҙәм PN кимәлендә күрһәткәнсә, Mfn2-AAV күп осраҡта ҡотҡарҙы ультраструктураһы митохондрия, нормаль мтДНК кимәле, һәм кире ҡайтарыу юғары экспрессияһы анти-ангиогенез маркеры PCx (һүрәт 4, С тиклем Е ). Ҡотҡарылған Mfn2cKO сысҡандарҙы ял хәлендә күҙ менән тикшергәндән һуң, уларҙы торошо һәм мотор симптомдары (S1-ҙән S3-кә тиклем хәрәкәт) яҡшырған. Һөҙөмтәлә, был тәжрибәләр күрһәтеүенсә, OXPHOS-та ныҡ етешһеҙлек кисергән ПН-ларға MFN2-не тотҡарлап ҡабаттан индереү мтДНК ҡулланыуын кире ҡайтарыу һәм атеросклерозды тыуҙырыу өсөн етә, шуның менән in vivo аксондар дегенерацияһын һәм нейрондар үлеменә юл ҡуймай.
(А) схема күрһәтеү өсөн эксперименталь график инъекция ААВ кодлау MFN2 ҡасан күрһәтелгән метаболизм юлы әүҙемләштерелә. (Б) 12 аҙналыҡ мейе өлөштәренең вәкиллекле конфокаль һүрәттәре 8 аҙнала Mfn2cKO сысҡандарында трансдукцияланған һәм анти-Кальбиндин антитән менән маркировкаланған. Уңда: аксон сүстәренең масштабланыуы. Аксон зумының масштабы 450 һәм 75 мкм тәшкил итә. (С) Һул: ААВ трансдукция иллюминаторында Пуркинже күҙәнәк тығыҙлығын миҡдар буйынса билдәләү (ААВ +) (дисперсияның бер яҡлы анализы; n = 3 сысҡан). Уңда: 12-се аҙнала трансдуцированный ПН-да мтДНК фокус анализы (парһыҙ t-тест; n = 6 күҙәнәк өс сысҡандан). * Р <0,05; ** Р <0,01. (D) күрһәтелгән вирус векторҙары менән трансдуцированный Mfn2cKO мейе бүлектәре PNs вәкиллекле тапшырыу электрон микрографиялары. Алһыу битлек дендриттар биләгән майҙанды, ә һары нөктәле квадрат уң яҡта бирелгән масштабты күрһәтә; n ядроны күрһәтә. Шкала бар, 1мкм. (Е) 12 аҙнала трансдуцированный ПН-да PCx буяу миҫалын күрһәтә. Масштаб бар, 20мкм. ОЭ, артыҡ экспрессия; ФК, ҡатлам үҙгәртеү.
Ниһайәт, беҙ тикшергән әһәмиәтен пероксидаза-индуцированный күҙәнәк йәшәү PNs, улар кисергән OXPHOS дисфункцияһы. Беҙ генерацияланған mCherry кодлау ААВ-шРНК (ҡыҫҡа заколка РНК) махсус маҡсатлы сысҡан PCx мРНК (ААВ-shPCx), һәм вирус йәки уның скрамблированный контроль (ААВ-scr) инъекция мейеһе Mfn2cKO сысҡандар. Инъекция дүртенсе аҙнала башҡарылған йәш (һүрәт 5А) һөҙөмтәле PCx нокаутҡа өлгәшеү өсөн осорҙа PCx экспрессияһы артты (һүрәт 3С) һәм PN күҙәнәк ҡатламы һаман да бөтөн (һүрәт 1А). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: PCx ҡолатыу (S8A һүрәте) PN үлемдең һиҙелерлек тиҙләнешенә килтерә, был зарарланған йөҙөк менән генә сикләнә (5-се һүрәт, В һәм С). PCx өҫкә көйләү индуцированный метаболизм эффекты механизмын аңлау өсөн, беҙ PCx нокауттан һуң PNs редокс статусын өйрәндек һәм AAV-медиированный оптик биодатчик Grx1-roGFP2 бер үк ваҡытта экспрессироваться (һүрәт S8, В тиклем D) баһалау өсөн глутатиод of potentix8 The relativx3). Һуңынан, беҙ ике фотонлы флуоресценция ғүмерлек образдар микроскопияһы (FLIM) киҫкен мейе киҫәктәрендә 7-аҙналыҡ Mfn2cKO йәки контроль littermates асыҡлау өсөн потенциаль үҙгәрештәр цитоплазма редокс статусы тикшергәндән һуң FLIM шарттары (һүрәт S8, Е G тиклем). Анализ күрһәткән һиҙелерлек артыу окисланыу хәле бер Mfn2cKO PNs етешмәй PCx экспрессияһы, был контроль нейрондар йәки Mfn2cKO PNs тик скремблированный shRNA экспрессия айырыла (һүрәт 5, D һәм E). Ҡасан PCx экспрессияһы түбән-көйләнгән, проценты Mfn2cKO PNs күрһәтеү юғары окисланған хәл өс тапҡырҙан ашыу артты (һүрәт 5Е), PCx өҫкә-көйләү һаҡлап ҡалған окисландырыу-ҡайтарыу ҡәҙерен нейрондар дегенерацияланған.
(А) схема күрһәтеү өсөн эксперименталь график инъекция ААВ кодлау shPCx ҡасан күрһәтелгән метаболизм юлы әүҙемләштерелә. (Б) 8 аҙналыҡ мейе өлөштәренең вәкиллекле конфокаль фотоһүрәттәре Mfn2cKO сысҡандарҙа трансдукцияланған һәм 4 аҙнала анти-кальциневин антитән менән маркировкаланған. Масштаб бар, 450мкм. (С) ААВ-трансдуцированный иллюминаторҙарҙа Пуркинже күҙәнәк тығыҙлығын миҡдар буйынса билдәләү (дисперсияның бер яҡлы анализы; n = 3-тән 4 сысҡанға тиклем). Мәғлүмәттәр уртаса±SEM тип бирелә; ***Р<0,001. (D) Вәкил FLIM һүрәте күрһәтә уртаса ғүмер оҙайлығы 7-аҙналыҡ PN экспрессировать глутатион окислительно-восстановительный датчик Grx1-roGFP2 күрһәтелгән эксперименталь шарттарҙа. LUT (эҙләү таблицаһы) нисбәте: йәшәү ваҡыты арауығы (пикосекундтарҙа). Масштаб бар, 25мкм. (Е) Гистограмма күрһәтә таралыу Grx1-roGFP2 ғүмер ҡиммәттәре (D) (n = 158 368 күҙәнәктәр ике сысҡан һәр шарттарҙа). Һәр гистограмма өҫтөндәге пирог диаграммаһы: күҙәнәктәр һаны һиҙелерлек оҙонораҡ (ҡыҙыл, окисланған) йәки ҡыҫҡараҡ (күк, кәметелгән) ғүмер оҙайлығы ҡиммәттәрен күрһәтә, улар CTRL-AAV-scr уртаса ғүмер оҙайлығы ҡиммәтенең 1 SD-нан артып китә. (F) Тәҡдим ителгән модель нейрон PCx өҫкә көйләү һаҡлау эффектын күрһәтә.
Ғөмүмән, беҙ бында биргән мәғлүмәттәр күрһәтеүенсә, MFN2-ның ҡабаттан экспрессияһы OXPHOS-тың ҡаты етешмәүсәнлеге, мтДНК-ның ҡаты кәмеүе һәм ифрат аномаль иста-кеүек морфологияһы менән алға киткән ПН-ды тулыһынса ҡотҡара ала, шуның менән хатта алға киткән ауырыуҙарҙа ла өҙлөкһөҙ алға китеш тәьмин итә. Нейродегенерация күҙәнәк үлеменә тиклемге этаптың кире ҡайтарыла торған дәлилдәрен бирә. Был дәрәжәлә матдәләр алмашыныуы һығылмалылығы артабан нейрондар атеросклерозды (ТСА циклының перепроводкаһы) тыуҙырыу мөмкинлеге менән һыҙыҡ өҫтөнә алына, был OXPHOS етешмәгән ПН-дарҙа PCx экспрессияһын тормошҡа ашыра һәм күҙәнәк үлеменә көсәйә, шуның менән һаҡлау ролен уйнай (5F һүрәте).
Был тикшеренеүҙең, беҙ дәлилдәр килтерҙе, тип яуап PNs OXPHOS дисфункцияһы яйлап дифференциаль әүҙемләштереү юлы аша ТСА циклы атеросклерозға яҡынлашыу өсөн әүҙемләштерелгән метаболизм программалары. Беҙ протеомик анализды күп тулыландырыусы ысулдар менән раҫланыҡ һәм митохондрияның ауыр дисфункцияһы менән бәхәсләшкәндә нейрондар метаболизм эластиклығының быға тиклем билдәһеҙ формаһына эйә булыуын асыҡланыҡ. Беҙҙең аптырап, бөтә процесы перепроводка мотлаҡ түгел, тип билдәләй терминаль метаболизм хәле, нейродегенерация яйлап һәм кире ҡайтарып булмаҫлыҡ оҙатып, әммә беҙҙең мәғлүмәттәр, тип фаразлай, ул нейрон техник хеҙмәтләндереүҙе тәшкил итә ала, хатта күҙәнәк үлеменә тиклемге этапта Функциональ компенсация механизмы. Был табыш нейрондар организмда ярайһы уҡ дәрәжәлә матдәләр алмашыныуы пластичлығына эйә булыуын күрһәтә. Был факт һуңыраҡ MFN2-не ҡабаттан индереү төп метаболизм маркерҙарының экспрессияһын кире ҡайтара алыуын һәм ПН-дың дегенерацияһын иҫкәртергә мөмкинлеген иҫбатлай. Киреһенсә, атеросклерозды тотҡарлай, нервыларҙы тиҙләтә. транссексуал.
Беҙҙең тикшеренеүҙең иң мауыҡтырғыс табыштарының береһе булып тора, тип PNs етешмәй OXPHOS үҙгәртә ала ТСА циклы алмашыныуын өҫкә көйләүсе ферменттар, махсус рәүештә артериосклероз стимуллаштырыу. Метаболизм үҙгәртеп ҡороу дөйөм үҙенсәлеге булып тора, яман шеш күҙәнәктәре, улар араһында ҡайһы берҙәре глутаминға таянып, ТСА циклы аралашсыларын тулыландырыу өсөн кәметкән эквиваленттар етештереү, улар тын алыу сылбырын драйвер һәм липид һәм нуклеотид биосинтезы прекурсорҙары етештереүҙе һаҡлау (39 , 40). Һуңғы тикшеренеүҙең күрһәтеүенсә, периферик туҡымаларҙа кисерә OXPHOS дисфункцияһы, глутамин/глутамат алмашыныуының ҡабаттан тоташтырылыуы ла күренекле үҙенсәлек булып тора (5, 41), унда йүнәлеше глутамин инеү ТСА циклына бәйле Сөнки ауырлыҡ OXPHOS йәрәхәтләнгән (41). ). Әммә организмда нейрондар алмашыныуы пластичлығының ниндәйҙер оҡшашлығы һәм уның сир контексында мөмкин булған актуаллеге тураһында аныҡ дәлилдәр юҡ. Һуңғы тикшеренеүҙең in vitro, беренсел кортикаль нейрондар нейротрансмиссия өсөн глутамат пулдарын мобилизациялау күрһәтелгән, шул рәүешле метаболизм стресс шарттарында окислывающий алмашыныу һәм атеросклерозға булышлыҡ итеү (42). Шуныһы иғтибарға лайыҡ: фармакологик тормошҡа ашырыу аҫтында ТСА циклы ферменты сукцинатдегидрогеназа, пируват карбоксилирование синтезын һаҡлау өсөн оксалоацетат культуралы нейрондар гранула мейеһе тип иҫәпләнә (34). Әммә был механизмдар мейе туҡымаһына (унда атеросклероз башлыса астроциттар менән генә сикләнә тип иҫәпләнә) физиологик әһәмиәткә эйә булыуы әле лә мөһим физиологик әһәмиәткә эйә (43). Был осраҡта беҙҙең мәғлүмәттәр күрһәтеүенсә, организмда OXPHOS зыян күргән PNs BCAA деградацияһына һәм пируват карбоксилләшеүенә күсерергә мөмкин, улар ТСА пулы аралашсыларын тулыландырыу өсөн ике төп сығанаҡ булып тора. BCAA катаболизмының нейрондар энергияһы алмашыныуына фаразланған өлөшө тәҡдим ителһә лә, нейротрансмиссия өсөн глутамат һәм ГАМК роленән тыш (44), был механизмдар өсөн әлегә дәлилдәр юҡ in vivo. Шуға күрә дисфункциональ ПН-дар атеросклерозды арттырыу юлы менән ассимиляция процесы менән идара ителгән ТСА аралашсыларын ҡулланыуҙы автоматик рәүештә компенсациялай ала тип фаразлау еңел. Атап әйткәндә, PCx upregulation аспартат кислотаһына ихтыяждың артыуын һаҡлау өсөн талап ителә ала, был митохондрия дисфункцияһы менән пролиферация күҙәнәктәрендә тәҡдим ителә (45). Әммә беҙҙең метаболомика анализы асыҡланманы ниндәй ҙә булһа әһәмиәтле үҙгәрештәр стабиль кимәлендә аспартат кислотаһы Mfn2cKO PNs (һүрәт S6A), был, фараз итеүенсә, төрлө метаболизм утилләштереү аспартат кислотаһы араһында пролиферация күҙәнәктәре һәм постмитоз нейрондар . in vivo дисфункциональ нейрондарҙа PCx-тың өҫкә көйләүенең теүәл механизмы характеристика бирелмәһә лә, беҙ был иртә яуаптың нейрондарҙағы окисландырыу-ҡайтарыу хәлен һаҡлауҙа мөһим роль уйнауын күрһәттек, был мейе киҫәктәрендәге FLIM тәжрибәләрендә күрһәтелде. Атап әйткәндә, PNs-ты PCx-ты өҫкә көйләүгә юл ҡуймау окисланған хәлгә килтерергә һәм күҙәнәктәрҙең үлеменә тиҙләтергә мөмкин. BCAA деградацияһын әүҙемләштереү һәм пируват карбоксилләү ысулдары түгел, характеристика бирергә периферик туҡымалар митохондрия дисфункцияһы (7). Шуға күрә улар нейродегенерация өсөн мөһим булған берҙән-бер үҙенсәлек булмаһа ла, ОКСФОС-дефицитлы нейрондарҙа өҫтөнлөклө үҙенсәлек булып тора кеүек. .
Мие ауырыуы нейродегенератив ауырыуҙар гетероген төрө булып тора, ғәҙәттә атаксия рәүешендә күренә һәм йыш ҡына ПН-дарҙы зыянлай (46). Был нейрон популяцияһы митохондрия дисфункцияһына айырыуса һиҙгер, сөнки уларҙы сысҡандарҙа һайлап алыу дегенерацияһы кешенең спиноцеребелляр атаксияһына хас булған күп кенә мотор симптомдарын тергеҙеү өсөн етә (16, 47, 48). Хәбәрҙәр буйынса, мутант генлы трансген сысҡан моделе кешенең спиноцеребелляр атаксияһы менән бәйле һәм митохондрия дисфункцияһына эйә (49, 50), PNPH-ла OXPHOS етешмәү эҙемтәләрен өйрәнеү мөһимлеген һыҙыҡ өҫтөнә ала. Шуға күрә был үҙенсәлекле нейрон популяцияһын һөҙөмтәле айырып алыу һәм өйрәнеү айырыуса ҡулай. Әммә, ПН-дар баҫымға бик һиҙгер булыуын һәм бөтә мейе күҙәнәктәре популяцияһының түбән өлөшөн тәшкил итеүен иҫәпкә алып, күп кенә омиктарға нигеҙләнгән тикшеренеүҙәр өсөн уларҙы тотош күҙәнәктәр итеп һайлап айырыу әле лә ауыр аспект булып тора. Башҡа күҙәнәк типтарын бысратыу абсолют булмауына өлгәшеү мөмкин булмаһа ла (бигерәк тә оло туҡымалар), беҙ FACS менән һөҙөмтәле диссоциация аҙымын берләштерҙек, етерлек һанлы йәшәүгә һәләтле нейрондарҙы алыу өсөн нижестоящий протеомика анализы, һәм Ярайһы уҡ юғары аҡһым ҡаплауы бар (яҡынса 3000 the cerebel the compare (51). Бөтә күҙәнәктәрҙең йәшәүсәнлеген һаҡлап, беҙ бында биргән ысул митохондриялағы матдәләр алмашыныу юлдарындағы үҙгәрештәрҙе тикшерергә генә түгел, ә уның цитоплазматик аналогтарындағы үҙгәрештәрҙе лә тикшерергә мөмкинлек бирә, был митохондрия мембранаһы биркаларын ҡулланыуҙы тулыландыра, күҙәнәктәрҙе байытыу өсөн number tissuria the New method (52, 53). Беҙ һүрәтләгән ысул Пуркинье күҙәнәктәрен өйрәнеү менән генә бәйле түгел, ә ауырыу мейеләге метаболизм үҙгәрештәрен, шул иҫәптән митохондрия дисфункцияһының башҡа моделдәрен хәл итеү өсөн күҙәнәктең теләһә ниндәй төрөнә еңел ҡулланырға мөмкин.
Ниһайәт, беҙ был метаболизмды үҙгәртеп ҡороу процесында күҙәнәк стрессының төп билдәләрен тулыһынса кире ҡайтара һәм нейрондар дегенерацияһын иҫкәртергә мөмкин булған дауалау тәҙрәһен асыҡланыҡ. Шуға күрә бында һүрәтләнгән перепроводканың функциональ эҙемтәләрен аңлау митохондрия дисфункцияһы ваҡытында нейрондар йәшәүсәнлеген һаҡлау өсөн мөмкин булған дауалау ысулдары тураһында төп төшөнсәләр бирергә мөмкин. Был принциптың башҡа неврологик ауырыуҙарға ла ҡулланыу мөмкинлеген тулыһынса асыу өсөн мейе күҙәнәктәренең башҡа төрҙәрендә энергия алмашыныуының үҙгәрештәрен диссекциялауға йүнәлтелгән киләсәктәге тикшеренеүҙәр кәрәк.
MitoPark сысҡандар тураһында быға тиклем һүрәтләнгән (31). C57BL/6N сысҡандар менән loxP фланкирование Mfn2 гендар һүрәтләнгән элек (18) һәм L7-Cre сысҡандар менән ҡапланған (23). Һөҙөмтәлә алынған икеләтә гетерозигот тоҡомдар артабан гомозигот Mfn2loxP/Mfn2loxP сысҡандары менән ҡатнаштырыла, Mfn2 өсөн Пуркинжеға хас ген нокауттарын генерациялай (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ҡушылыу подгруппаһында Gt (ROSA26) SorStop-мито-YFP аллеле (туҡталыш-mtYFP) өҫтәмә киҫелештәр аша индерелгән (20). Бөтә хайуандар процедуралары Европа, милли һәм институциональ йүнәлештәргә ярашлы башҡарылған һәм Германияның Төньяҡ Рейн-Вестфалия ҡалаһының Умвелт һәм Verbraucherschutz ҡалаларындағы LandesamtfürNatur тарафынан раҫланған. Хайуандар менән эшләү шулай уҡ Европа лаборатория хайуандары тураһында фәндәр ассоциациялары федерацияһы етәкселегенә ярашлы бара.
Ауырлы ҡатындың аналыҡ муйынсағы дислокацияһын наркозға һалғандан һуң сысҡан эмбрионын айырып алалар (Е13). мМ Hepes менән тулыландырылған Хэнкстың баланслы тоҙ иретмәһендә (HBSS) ҡабыҡ диссекциялана һәм составында папаин (20 Е/мл) һәм цистеин (1 мкг/мл) булған Дульбекконың модификацияланған бөркөт уртаса аша үткәрелә. Туҡыманы ДМЭМ-да инкубациялайҙар) һәм ферментлы аш һеңдереүҙең ярҙамында диссоциациялайҙар. Мл) 37°С температурала 20 минут, һуңынан 10% һыйыр ҡан һыуытҡысы менән тулыландырылған ДМЭМ-да механик рәүештә тарттырыла. см культура тәрилкәһенә 2×106 тығыҙлыҡта йәки 0,5×105 күҙәнәк/см2 тығыҙлыҡта анализлау өсөн полилизин менән ҡапланған быяла ҡаплаусы ҡатламдарға күҙәнәктәр сәселгән. сәғәттән һуң 1% В27 өҫтәмәһе һәм 0,5 мМ GlutaMax булған Neurobasal ҡан һыуытҡысы булмаған матдә менән алмаштырыла. Артабан нейрондарҙы тәжрибә барышында 37°С һәм 5% CO2 температураһында тоталар, аҙнаһына бер тапҡыр туҡландыралар. In vitro рекомбинацияны индукциялау маҡсатында икенсе көндө in vitro нейрондарҙы дауалау өсөн түбәндәге AAV9 вирус векторының 3 мкл (24 скважиналы культура тәрилкәһе) йәки 0,5 мкл (24 скважиналы пластинка) ҡулланылған: AAV9.CMV.PI.eGFP. 105530-ААВ9 каталог номеры һәм ААВ9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Адген, каталог номеры 105545-ААВ9).
Сысҡан Mfn1 һәм Mfn2 комплементар ДНК-һы (Addgene плазмидаһынан алынған #23212 һәм #23213, ярашлы рәүештә) С-осонда V5 эҙмә-эҙлеклелеге (GKPIPNPLLGLDST) менән билдәләнә, һәм mCherry менән кадрҙа T2A эҙмә-эҙлеге аша ҡушыла. Grx1-roGFP2 — Гейдельберг Т.П.Дик ДФКЗ-ның (Немец тикшеренеү үҙәге) бүләге. Ғәҙәти клонлау ысулдары ҡулланып tdTomato кассетаһын алмаштырып, кассета pAAV-CAG-FLEX-tdTomato нигеҙенә (Addgene һылтанма номеры 28306) субклонланған, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV2-V5 генерациялау өсөн. ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН1-В5 һәм пААВ-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 векторҙары. Оҡшаш стратегия pAAV-CAG-FLEX-mCherry контроль векторын генерациялау өсөн ҡулланылған. ААВ-шПКх конструкцияһын генерациялау өсөн плазмид ААВ векторы (VectorBuilder, pAAV [шРНК] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [шРНК#1]) кәрәк, унда шРНК таргетинг сысҡан ПКх (5′ 3′) U6 промоторы контроле аҫтында mCherry CMV промоторы контроле аҫтында ҡулланыла. Ярҙамсы ААВ векторҙарын етештереү етештереүсенең күрһәтмәһе буйынса башҡарылған (Cell Biolabs). Ҡыҫҡаһы, мЧерри-Т2А-МФН2-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5), мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) йөрөтөүсе күсермә плазмидаһын ҡулланыу мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) ваҡытлыса-Трансфекция мФЦВАВ-3). (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) йәки Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодлау гены, шулай уҡ кодлау AAV1 капсид аҡһым һәм аксессуар аҡһым Упаковка плазмида плазмида, кальций фосфаты ысулын ҡулланып. Ҡоро боҙ/этанол ваннаһында туңдырыу-иретеү циклдары һәм күҙәнәктәрҙе фосфат буферлы тоҙло һыуҙа (ПБР) лизлау юлы менән сей вирус супернатанты алынған. ААВ векторы өҙлөкһөҙ йодиксанол градиентлы ультрацентрифугалау юлы менән таҙартыла (32 000 әйләнеш/мин һәм 4°С температурала 24 сәғәт) һәм Amicon ультра-15 үҙәктән ҡасыу фильтры ярҙамында концентрациялана. 1013 геном күсермәһе (ГС)/мл, ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри (6,1×1012 ГК/мл), ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5 геном титры элеккесә үлсәп сығарылған. (кПЦР) -МФН1-В5 (1,9 × 1013 ГК/мл) һәм ААВ1-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 (8,9 × 1012 ГК/мл).
Беренсел нейрондар боҙло һыуыҡ 1x PBS ҡырҡып алынған, гранулалар, ә һуңынан 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолаты/PBS лизис буферы составында фосфатаза һәм протеаза ингибиторы (Roche) гомогенлаштырылған. Аҡһымдың миҡдарын билдәләү бицинхонин кислотаһы анализы (Thermo Fisher Scientific) ярҙамында башҡарылған. Һуңынан аҡһымдарҙы SDS-полиакриламид гель электрофорезы ярҙамында айырып алалар, һуңынан поливинилиденфторид мембранаһына (GE Healthcare) ҡаплайҙар. Блокировать специфик булмаған урындар һәм инкубация менән беренсел антитело (ҡара: таблица S1 өсөн ентеклерәк) 5% һөт TBST (Трис-буферлы тоҙло раствор менән Tween), йыуыу аҙымдары һәм икенсел антитело TBST Incubate. Беренсел антитело менән төнө буйы +4°С температурала инкубациялайҙар. Йыуғандан һуң икенсел антителоны бүлмә температураһында 2 сәғәткә һөртөргә. Артабан шул уҡ блотты анти-β-актин антитән менән инкубациялау юлы менән шул уҡ йөкләнеш раҫланған. Химилюминесценцияға үҙгәртеп һәм химилюминесценцияны көсәйткән асыҡлау (GE Healthcare).
минут дауамында бүлмә температураһында билдәләнгән ваҡыт нөктәһендә 4% параформальдегид (ПФА)/ПФС менән нығытылған нейрондар быяла ҡаплаусы ҡатламдарға элек сәселгән. Ҡаплаусы ҡатламдар тәүҙә бүлмә температураһында 5 минут дауамында 0,1 процентлы Тритон Х-100/ПФС менән үтеп инә, ә һуңынан блоклау буферында [3 процентлы һыйыр ҡан һыуытҡысы альбумины (БСА)/ПФС]. Икенсе көндө ҡаплаусы ҡатламдарҙы блоклаусы буфер менән йыуалар һәм бүлмә температураһында 2 сәғәт буйы тейешле флюорофор менән конъюгацияланған икенсел антитән менән инкубациялайҙар; ниһайәт, өлгөләрҙе 4′,6-диамидино-2 -Фенилиндол (DAPI) менән PBS-та ныҡлап йыуғандар, ә һуңынан микроскоп слайдында Aqua-Poly/Mount менән нығытылған.
Сысҡандар (ир-ат һәм ҡатын-ҡыҙ) наркоз ҡорһаҡ эсенә инъекция кетамин (130 мг/кг) һәм ксилазин (10 мг/кг) һәм тире аҫтына индереү менән карпрофен анальгетик (5 мг/кг) , Һәм стереотактик инструмент менән урынлаштырылған (Kopped a war) equimf. Баш һөйәген асып, теш бурауы ярҙамында мейе ҡабығының мис һөйәгенә тап килгән өлөшөн нәҙегәйтергә (лямбданан: ҡойроҡ 1,8, ян 1, IV һәм V лобуляларға тап килгән). Кәкре шприц энәһен ҡулланып, баш һөйәгендә һаҡ ҡына бәләкәй генә тишек эшләгеҙ, аҫтағы ҡан тамырҙары боҙолмаһын өсөн. Һуңынан нәҙек тартылған быяла капилляр яйлап микро-тишеккә индерелә (-1,3-тән -1-гә тиклем ҡаты матдәнең вентраль яғында), ә 200-ҙән 300 нл ААВ микро-инжекторға (Наришиге) ҡул шприцтары менән (Наришиге) осорҙа бер нисә ваҡытҡа тиклем инъекциялана. минут тәҙрәһе. Инфузиянан һуң капиллярҙы тағы ла 10 минутҡа урынлаштырырға, вирус тулыһынса таралһын өсөн. Капиллярҙарҙы сығарғандан һуң, яра ялҡынһыныуын кәметергә һәм малдың һауығыуына мөмкинлек бирер өсөн тирен һаҡ ҡына тегеп алалар. Операциянан һуң бер нисә көн малдарҙы ауыртыуҙы баҫыусы препараттар (каспофен) менән дауалайҙар, был ваҡыт эсендә уларҙы физик хәле ентекле күҙәтелә, һуңынан билдәләнгән ваҡытта эвтаназияға дусар ителә. Бөтә процедуралар ҙа Европа, милли һәм институциональ йүнәлештәргә ярашлы үткәрелгән һәм Германияның Төньяҡ Рейн-Вестфалия ҡалаһының Умвелт һәм Verbraucherschutz ҡалаларындағы LandesamtfürNatur тарафынан раҫланған.
Хайуандарҙы кетамин (100 мг/кг) һәм ксилазин (10 мг/кг) менән наркозлайҙар, йөрәккә тәүҙә 0,1 М ПФС, һуңынан ПФС-та 4% ПФА перфузиялайҙар. Туҡыма диссекцияланған һәм 4% PFA/PBS 4°C температурала төнө буйы нығытылған. ПБС-та нығытылған мейенән сагитал өлөштәр (ҡалынлығы 50 мкм) әҙерләү өсөн вибрациялы бысаҡ (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) ҡулланылған. Әгәр башҡаса күрһәтелмәһә, ирекле йөҙөүсе өлөштәрҙе буяу бүлмә температураһында һәм болғатыуҙа өҫтә һүрәтләнгәнсә башҡарылған (13). Ҡыҫҡаһы, беренсенән, алынған өлөштәрҙе бүлмә температураһында 15 минут дауамында 0,5% Triton X-100/PBS менән пермеабилизациялайҙар; Ҡайһы бер эпитоптар өсөн (Pcx һәм Shmt2), 80°C (PH 9) температурала трис-ЭДТА буферында был аҙым урынына 25 минут йылыта. Артабан, бүлектәр менән инкубировать беренсел антитело (ҡара: таблица S1) блокировка буферы (3% BSA/PBS) 4°C төнө буйы болғатыу менән. Икенсе көндө өлөштәрҙе блоклау буферы менән йыуалар һәм бүлмә температураһында 2 сәғәт буйы тейешле флюорофор менән конъюгацияланған икенсел антитән менән инкубациялайҙар; ниһайәт, өлөштәрҙе PBS-та ныҡлап йыуалар, DAPI менән контр-буяйҙар, һуңынан AquaPolymount менән микроскоп слайдында нығыталар.
Өлгө һүрәтләү өсөн аҡ яҡтылыҡ лазеры һәм 405 диодлы ультрафиолет лазеры менән йыһазландырылған лазерлы сканерлау конфокаль микроскобы (TCS SP8-X йәки TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ҡулланылған. Флюорофорҙы ҡуҙғытыу һәм сигналды гибрид детекторы (HyDs) менән йыйыу юлы менән LAS-X программа тәьминәте эҙмә-эҙлекле режимда Никвист үлсәүенә ярашлы өйөлгән һүрәттәрҙе йыйыу өсөн ҡулланылған: миҡдарһыҙ панелдәр өсөн был юғары динамик сигналдар (мәҫәлән, соматик күҙәнәктәрҙә һәм дендриттарҙа UFPN-да dect) mt ЯҡтыR режимы). Фонды кәметергә 0,3-тән 6 нс-ҡа тиклем ҡапҡалар ҡулланыла.
Сортланған күҙәнәктәрҙе реаль ваҡытта төшөрөү. Һуң сорттарға нейробазаль-А уртаса содержащий 1% В27 өҫтәмә һәм 0.5 мМ GlutaMax, күҙәнәктәр шунда уҡ поли-l-лизин-ҡапланған быяла слайдтар өҫтөндә орлоҡланған (μ-Слайд8 Ну, Ibidi, каталог номеры 80826) , Һәм һуңынан уны һаҡлау өсөн а% CO2s to57. төпләнергә. Реаль ваҡытта һүрәт төшөрөү Leica SP8 лазерлы сканерлау конфокаль микроскопында башҡарылған, ул аҡ лазер менән йыһазландырылған, HyD, 63×[1.4 һанлы диафрагмалы (NA)] майлы объектив линзаһы һәм йылытыу этабы.
Сысҡан тиҙ углекислый газ менән наркоз һәм башын ҡырҡып, мейе тиҙ генә баш һөйәгенән сығарылған, һәм 200мкм ҡалынлыҡта ҡырҡып (13С маркировка эксперименты өсөн) йәки 275мкм ҡалынлығында (ике фотон тәжрибәһе өсөн) сагитталь бүлек тултырылған түбәндәге материалдар менән creceam The VHr50). Scientific, Вальдорф, Германия) түбәндәге матдәләр менән тултырылған: 125 мМ боҙло һыуыҡ, углерод менән туйындырылған (95% O2 һәм 5% CO2) түбән Ca2 + яһалма мейе-умыртҡа шыйыҡсаһы (ACHCSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий м3, Na32. глюкоза, 0,5 мМ CaCl2 һәм 3,5 мМ MgCl2 (осмотик баҫым 310—330 ммоль) ҡатнаша. Алынған мейе киҫәктәрен инкубация алдынан камераға күсерергә, унда юғарыраҡ Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буферы, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза һәм Ca2C м01 MgCl2) Уртаса) рН 7,4 һәм 310—320 ммоль).
Һүрәт төшөрөү процесында өлөштәрҙе махсус һүрәт төшөрөү бүлмәһенә күсерәләр, ә тәжрибә 32°-тан 33°С-ҡа тиклем даими температурала өҙлөкһөҙ АКСФ перфузияһы аҫтында үткәрелә. Ҡырҡылған һүрәттәрҙе төшөрөү өсөн Leica 25x объектив линзаһы (NA 0,95, һыу), Ti: Sapphire лазеры (Chameleon Vision II, Coherent) менән йыһазландырылған күп фотонлы лазерлы сканерлау микроскобы (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ҡулланылған. FLIM модуле (ПикоХарп300, ПикоКвант).
Грх1-роГФП2-нең ФЛИМ-ы. ПН-дар цитоплазма окисландырыу-ҡайтарыу хәлендәге үҙгәрештәрҙе сагитталь мейе киҫәктәрендә ике фотонлы ФЛИМ ярҙамында үлсәгәндәр, унда Grx1-roGFP2 биодатчикы ПН-дарға йүнәлтелгән. PN ҡатламында, алыу яланында һайлана яҡынса 50 80 мкм аҫтында өлөшө өҫтөндә тәьмин итеү өсөн, йәшәүгә һәләтле PN (йәғни, етешмәүе бисер структураһы йәки нейрон морфологик үҙгәрештәр буйлап дендриттар) һәм икеләтә ыңғай seGFP2 датчигы һәм AAVx codinging shRNAe мЧерри). 2x һанлы зум менән бер стекалы һүрәттәр йыйыу [ҡуҙғытыу тулҡынының оҙонлоғо: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Асыҡлау: эске HyD, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) фильтр төркөмө] һәм һүрәт уртаса 2 3 минут эсендә ҡулланыла, тип тәьмин итеү өсөн етерлек фотондар йыйыла (1000 фотондар дөйөм) өсөн ҡойроҡ тура килтереп. Һиҙгерлек Grx1-roGFP2 зонд һәм тикшерелгән FLIM шарттары башҡарылған мониторинг ғүмер ҡиммәте roGFP2 өҫтәгәндә экзоген 10 мМ H2O2 перфузия ACSF (окисланыуҙы максималь кимәлгә еткерергә, һөҙөмтәлә ғүмер оҙайлығын арттырыу өсөн deminimizethol of кәметергә, һөҙөмтәлә ғүмер оҙайлығы кәмей) (S8 һүрәте, D - G). Ҡулланыу FLIMfit 5.1.1 программа тәьминәте анализлау өсөн алынған һөҙөмтәләр, тура килә бер экспоненциаль тарҡалыу ҡойроғо бөтә һүрәт үлсәү IRF (инструмент яуап функцияһы), һәм χ2 яҡынса 1. Иҫәпләү өсөн ғүмер оҙайлығы бер PN, битлек булды liach тирәләй нервы . миҡдарҙы билдәләү өсөн ҡулланыла.
Митохондрия потенциалын анализлау. Киҫкен өлөш туранан-тура перфузияланған АКСФ-ҡа өҫтәлгән 100 нМ ТМРМ менән 30 минут инкубацияланғандан һуң, ПН-дарҙағы митохондрия потенциалы үҙгәрештәре ике фотонлы микроскоп ярҙамында үлсәнә. TMRM һүрәтләү 920 нм-ҙа зондты ҡуҙғытыу һәм сигналдар йыйыу өсөн эске HyD (тетраметилродамин изотиоцианаты: 585/40 нм) ҡулланып башҡарылған; Ҡулланыу аша бер үк ҡуҙғытыу тулҡын оҙонлоғо, әммә ҡулланыу өсөн башҡа эске HyD (FITC :525/50) образы mtYFP. ImageJ ҡулланыу һүрәт калькулятор плагин баһалау өсөн митохондрия потенциалы бер күҙәнәк кимәлендә. Ҡыҫҡаһы, плагин тигеҙләмәһе: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) тейешле каналдың бер стекалы конфокаль һүрәтендә Пуркинже сомали телендә ТМРМ сигналын күрһәткән митохондрия өлкәһен билдәләү өсөн ҡулланыла. Һуңынан һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән битлектәге пиксель майҙаны һанлаштырыла, ә һуңынан mtYFP каналының тейешле сиктәге бер стекалы һүрәтендә нормалаштырыла, митохондрия потенциалын күрһәткән митохондрия фракцияһын ала.
Һүрәт Huygens Pro (фәнни күләм һүрәтләү) программаһы менән деконволюцияланған. Плиткаларҙан сканерланған һүрәттәр өсөн бер плитканың монтажы LAS-X программа тәьминәте менән тәьмин ителгән автоматик тегеү алгоритмы ярҙамында эшләнә. Һүрәтте калибрлағандан һуң ImageJ һәм Adobe Photoshop программаларын ҡулланып, һүрәтте артабан эшкәртергә һәм сағыулыҡты һәм контрастты бер тигеҙ көйләргә мөмкин. График әҙерләү өсөн Adobe Illustrator программаһын ҡулланығыҙ.
мтДНК фокус анализы. мтДНК имгәнеүҙең һаны конфокаль микроскоп ярҙамында ДНК-ға ҡаршы антитәнсәләр менән билдәләнгән мейе өлөштәрендә һанлаштырылған. Һәр маҡсатлы майҙан күҙәнәк тәне һәм һәр күҙәнәктең ядроһы өсөн булдырылған, ә тейешле майҙан Multi Measure плагины (ImageJ программаһы) ярҙамында иҫәпләнгән. Ядро майҙанын күҙәнәк тән майҙанынан кәметеп, цитоплазма майҙанын алабыҙ. Ниһайәт, Analyze Particles плагины (ImageJ программа тәьминәте) автоматик рәүештә мтДНК-ны күрһәткән цитоплазма ДНК нөктәләрен порог һүрәтендә һанлаштырыу өсөн ҡулланылған, ә алынған һөҙөмтәләр CTRL сысҡандарының уртаса PN-ына нормалаштырылған. Һөҙөмтәләр бер күҙәнәктә уртаса нуклеозидтар һаны менән бирелә.
Аҡһым экспрессияһын анализлау. ImageJ ҡулланыу һүрәт калькулятор плагин баһалау өсөн аҡһым экспрессияһы PN бер күҙәнәк кимәлендә. Ҡыҫҡаһы, тейешле каналдың бер ҡатлы конфокаль һүрәтендә: сигнал = мин (mtYFP, антитело) тигеҙләмәһе аша Пуркинала билдәле бер антителоға иммунореактивлыҡ күрһәткән митохондрия өлкәһе билдәләнә. Һуңынан һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән битлектәге пиксель майҙаны һанлаштырыла, ә һуңынан mtYFP каналының тейешле сикле бер стекалы һүрәтендә нормалаштырыла, күрһәтелгән аҡһымдың митохондрия өлөшөн ала.
Пуркинже күҙәнәк тығыҙлығын анализлау. ImageJ-дың Cell Counter плагины Пуркинже тығыҙлығын баһалау өсөн ҡулланылған, уларҙы иҫәпләгән Пуркинже күҙәнәктәренең һанын иҫәпләнгән күҙәнәктәр биләгән мейе йөҙөгө оҙонлоғона бүлеп ҡулланғандар.
Өлгө әҙерләү һәм йыйыу. Контроль төркөмдән һәм Mfn2cKO сысҡандарҙан мейе 2% PFA/2.5% глутаральдегид 0,1 М фосфат буферында (ПБ) нығытылған, ә һуңынан корональ бүлектәр ҡулланып әҙерләнгән ресницалар (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрияла) (Ҡалынлыҡ 50 тиклем ThePBn буфер нығытыу) тетраоксид һәм 1,5% калий ферроцианиды бүлмә температураһында 1 сәғәт. Бүлексәләрҙе өс тапҡыр дистиллированный һыу менән йыуалар, һуңынан 20 минут дауамында 1% уранилацетатлы 70% этанол менән буяйҙар. Һуңынан өлөштәрҙе градациялы спиртта һыуһыҙландыралар һәм Дуркупан АСМ (Аралдит ҡойоу смолаһы М) эпоксид смолаһы (Электрон микроскопияһы фәндәре, каталог номеры 14040) кремний менән ҡапланған быяла слайдтар араһында һалалар, ә ниһайәт, 60°С температурала мейестә полимерлаштыралар48 hours. Һайланған һәм 50 нм ультранәҙек өлөштәр Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) өҫтөндә ҡырҡылған һәм полистирол пленка менән ҡапланған 2×1 мм баҡыр ярсыҡ селтәрендә йыйып алынған. Бүлексәләрҙе 4% уранилацетат иретмәһе менән 10 минут буяйҙар, бер нисә тапҡыр H2O менән йыуалар, артабан 10 минут буйы H2O-ла Рейнольдс ҡурғаш цитраты менән йыуалар, һуңынан бер нисә тапҡыр H2O менән йыуалар. Микрографиялар тапшырыу электрон микроскобы Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс штаты, АҠШ) менән TVIPS (Титц видео һәм һүрәт эшкәрткән системаһы) TemCam-F416 һанлы камераһы (TVIPS GmbH, Гаутинг, АҠШ) ярҙамында төшөрөлгән. Германия).
ААВ менән зарарланған сысҡандар өсөн мейене айырып, 1 мм ҡалынлыҡтағы сагитал өлөшкә ҡырҡҡандар, ә мейе өлөшөн флуоресценция микроскопы ярҙамында тикшергәндәр, ААВ менән зарарланған йөҙөктө (йәғни mCherry экспрессиялаусы) асыҡлағандар. Тик ААВ инъекцияһы һөҙөмтәһендә Пуркинже күҙәнәк ҡатламының (йәғни бөтә ҡатламдың тиерлек) кәмендә ике рәттән мейе йөҙөктәрендә бик юғары трансдукция һөҙөмтәлелегенә килтергән тәжрибәләр генә ҡулланыла. ААВ-трансдуцированный петля микродиссекция өсөн төнө буйы постфиксация (4% ПФА һәм 2,5% глутаральдегид 0,1 М кокао буферы) һәм артабан эшкәртелгән. EPON встраивание өсөн, нығытылған туҡыма йыуылған 0,1 М натрий какао буферы (Applichem), һәм инкубировать 2% OsO4 (os, Фән хеҙмәттәре; Caco) 0,1 М натрий какао буферы (Applichem) 4 Сәғәт, һуңынан йыуып 2 сәғәт. тапҡыр 0,1 М кокамид буферы менән ҡабатларға. Артабан өҫкә күтәрелеүсе этанол серияһы ҡулланып, туҡыманы һыуһыҙландырыу өсөн һәр этанол иретмәһен 4°С температурала 15 минут инкубациялайҙар. Туҡыманы пропилен оксидына күсерәләр һәм 4°С температурала ЭПОН-да (Сигма-Ольдрих) төнө буйы инкубациялайҙар. Туҡыманы бүлмә температураһында яңы ЭПОН-ға 2 сәғәт һалабыҙ, һуңынан 62°С температурала 72 сәғәт һалабыҙ. Ультрамикротом ҡулланыу (Leica Microsystems, UC6) һәм алмаз бысаҡ (Diatome, Биль, Швейцария) 70 нм ультранәҙек өлөштәрҙе ҡырҡып, һәм 1,5% уранилацетат менән 15 минут 37°C, һәм тап менән ҡурғаш цитраты иретмәһе 4 минут. Электрон микрографиялар Camera OneView 4K 16-битлы (Гатан) һәм DigitalMicrograph программалары (Гатан) менән йыһазландырылған JEM-2100 Plus тапшырыу электрон микроскобы (JEOL) ярҙамында төшөрөлгән. Анализ өсөн 5000× йәки 10000× һанлы зум менән электрон микрографиялар алынған.
Митохондрияларҙы морфологик анализлау. Бөтә анализдар өсөн айырым митохондриялар контурҙары ImageJ программаһы ярҙамында һанлы һүрәттәрҙә ҡул менән һыҙылған. Төрлө морфологик күрһәткестәр анализлана. Митохондрия тығыҙлығы һәр күҙәнәктең дөйөм митохондрия майҙанын цитоплазма майҙанына бүлеп алынған процент менән бирелә (цитоплазма майҙаны = күҙәнәк майҙаны-күҙәнәк ядроһы майҙаны) × 100. Митохондриялар түңәрәклеге [4π∙2(майҙан)/периметр] формулаһы менән иҫәпләнә. Митохондрияларҙағы иста морфологияһы анализланған һәм төп формалары буйынса ике категорияға («трубкалы» һәм «ҡыуыҡлы») бүленгән.
Аутофагосома/лизосома һаны һәм тығыҙлығын анализлау. ImageJ программа тәьминәтен ҡулланып, һанлы һүрәттәге һәр аутофагосома/лизосоманың контурҙарын ҡул менән һыҙығыҙ. Аутофагосома/лизосома майҙаны һәр күҙәнәктең дөйөм аутофагосома/лизосома структураһы майҙанын цитоплазма майҙанына бүлеп иҫәпләнгән проценттар менән бирелә (цитоплазма майҙаны=күҙәнәк майҙаны-ядро майҙаны)×100. Аутофагосомалар/лизосомалар тығыҙлығы дөйөм һанды бер күҙәнәктәге аутофагосома/лизосома структуралары һаны менән бүлеп иҫәпләнә (цитоплазма майҙаны буйынса) (цитоплазма майҙаны = күҙәнәк майҙаны-ядро майҙаны).
Киҫкен секциялау һәм өлгө әҙерләү өсөн маркировкалау. Глюкоза маркировкаһын талап иткән тәжрибәләр өсөн киҫкен мейе киҫәктәрен инкубация алдынан камераға күсерергә, унда туйындырылған углерод (95% O2 һәм 5% CO2), юғары Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий мМ2O, 1,25 мМ натрий фосфаты) бар. 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl 2 һәм 2,0 мМ MgCl 2, рН 7,4 һәм 310 320 мОсм тиклем көйләнгән), унда глюкоза 13 С 6- Глюкоза алмаштырыу (Eurisotop, каталог номеры CLM9-1). Тәжрибәләр өсөн, пируват маркировка талап итә, киҫкен мейе киҫәктәрен юғары Ca2 + ACSF күсерергә (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буферы, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ Ad.2M м-глюкоза һәм Ca02m MgCl2, рН 7,4 һәм 310 320мОсм тиклем көйләү), һәм 1мМ 1-[1-13С]пируваты (Еврисотоп, каталог номеры CLM-1082) өҫтәйҙәр. Бүлексәләрҙе 37°С температурала 90 минут инкубациялайҙар. Тәжрибә аҙағында өлөштәрҙе тиҙ арала 75 мМ аммиак карбонаты булған һыулы иретмә (рН 7,4) менән йыуалар, һуңынан 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилдә (ACN): метанол: һыуҙа гомогенлаштыралар. минут боҙҙа өлөштәрҙе инкубациялағандан һуң өлгөләрҙе 21 мең г температурала 4°С температурала 10 минут центрифугалайҙар, асыҡ супернатантты SpeedVac концентраторында киптерәләр. Һөҙөмтәлә алынған киптерелгән метаболит гранулаһы анализға тиклем -80°С температурала һаҡлана.
С-маркировкалы аминокислоталарҙы шыйыҡса хроматографияһы-масс-спектрометрия анализы. Һыулы хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) анализы өсөн метаболит пеллеты 75 мкл ЖХ-МС сортлы һыуҙа (Honeywell) ресуспендировать ителә. 000 г температурала 4°С температурала 5 минут центрифугалағандан һуң аминокислота ағымы анализы өсөн 20 мкл асыҡланған супернатант ҡулланыла, ә ҡалған экстракт шунда уҡ анион анализы өсөн ҡулланыла (аҫта ҡарағыҙ). Аминокислоталар анализы бензоилхлорид дериватизация протоколы ҡулланып башҡарылған (55, 56). Беренсе аҙымда 20 мкл метаболит экстрактына 10 мкл 100 мМ натрий карбонаты (Сигма-Ольдрих) өҫтәлгән, һуңынан 10 мкл 2% бензоилхлориды (Сигма-Ольдрих) LC сортлы ACN өҫтәлгән. Өлгө ҡыҫҡа ваҡытҡа әйләндерелә, һуңынан 21 000 г температурала 20°С температурала 5 минут центрифугалана. Таҙартылған супернатантты 2 мл автопробирка флаконына конус формаһындағы быяла индереү (200 мкл күләме) менән күсерергә. Өлгөләрҙе анализлау өсөн ҡулланылған Acquity iClass ультра-юғары етештереүсәнлекле LC системаһы (Һыуҙар) тоташтырылған Q-Exactive (QE)-HF (Ультра Юғары Ялан Орбитрап) юғары асыҡлыҡтағы теүәл масс-спектрометр (Термо Фишер ғилми). Анализ өсөн 2 мкл деривативлаштырылған өлгө 100×1,0 мм юғары ныҡлыҡтағы кремний Т3 колонкаһына (Һыуҙар) 1,8 мкм киҫәксәләрҙән торған инъекциялана. Ағым тиҙлеге 100 мкл/мин тәшкил итә, ә буфер системаһы А буферынан (10 мМ аммиак формальдегы һәм һыуҙа 0,15% ҡырмыҫҡа кислотаһы) һәм В буферынан (ACN) тора. Градиент түбәндәгесә: 0 минутта 0%В; 0%Б. 0-дан 15% В 0-дан 0,1 минутҡа тиклем; 15—17% В 0,1—0,5 минутта; В 17-нән 55%-ҡа тиклем 0,5-тән 14 минутҡа тиклем; В 55-тән 70%-ҡа тиклем 14-тән 14,5 минутҡа тиклем; 14,5-тән 70-кә тиклем 100% В 18 минутта; 18-19 минутта 100% В; 19—19,1 минутта 100-ҙән 0% В; 0% В 19,1-ҙән 28 минутҡа тиклем (55, 56). QE-HF масс-спектрометр ыңғай ионизация режимында эшләй масса диапазоны менән м/з (масса/заряд нисбәте) 50 750. Ҡулланылған ҡарар 60,000, һәм өҫтәү контроле (AGC) ион маҡсатлы алынған 3×106, һәм максималь ион ваҡыт milli0co1. Йылытылған электроспрей ионлаштырыу (ЭПИ) сығанағы 3,5 кВ һиптергес көсөргәнешендә, 250°С капилляр температураһында, тышлыҡ һауа ағымында 60 АЕ (ирекле берәмектәр) һәм 20 АЕ ярҙамсы һауа ағымында эшләй. 250°С. S линзаһы 60 АЕ ҡуйылған.
Анион хроматографияһы-МС анализ 13С маркировкаланған органик кислоталар. Ҡалған метаболит ятҡылығы (55 мкл) QE-HF масс-спектрометрына (Термо Фишер Scientific) тоташтырылған Dionex ион хроматографияһы системаһы (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ярҙамында анализланған. Ҡыҫҡаһы, 5мкл метаболит экстракт дионекс IonPac AS11-HC колонкаһы менән йыһазландырылған ВЭЖХ (2 мм×250 мм, киҫәксәләр күләме 4мкм, Термо Фишер фәнни) push-in өлөшләтә иллюминатор режимында тултырыу нисбәте менән co HC мм13 мм13. 4мкм, Термо Фишер фәнни). Колонка температураһы 30°С-та һаҡлана, ә автопробирка 6°С-ҡа ҡуйыла. Деионлаштырылған һыу менән тәьмин ителгән калий гидроксиды картриджы ҡулланыу өсөн элюент генераторы аша калий гидроксиды градиент генерациялау. 380 мкл/мин тиҙлектә метаболиттарҙы айырыу, түбәндәге градиент ҡулланып: 0-дан 3 минутҡа тиклем, 10 мМ КОН; 3-тән 12 минутҡа тиклем, 10-дан 50 мМ КОН; 12—19 минут, 50—100 мМ КОН; 19 21 минут , 100 мМ КОН; 21 21,5 минут, 100 10 мМ КОН. Колонка 10 мМ КОН аҫтында 8,5 минут яңынан тигеҙләнә.
Элюированный метаболиттар менән берләштерелә 150мкл/мин изопропанол өҫтәмә ағымы колонканан һуң һәм һуңынан юғары асыҡлыҡтағы масс-спектрометрға йүнәлтелгән, ул кире ионизация режимында эшләй. MS 60,000 асыҡлыҡ менән m/z 50-нән 750-гә тиклем масса диапазонын күҙәтә. АГК 1×106 тип ҡуйыла, ә максималь ион ваҡыты 100 мс һаҡлана. Йылытылған ЭСИ сығанағы 3,5 кВ һиптергес көсөргәнештә эшләгән. Ион сығанағының башҡа параметрҙары түбәндәгесә: капилляр температураһы 275°С; тышлыҡ газ ағымы, 60 АЕ; ярҙамсы газ ағымы, 300°С температурала 20 АЕ, ә S линзаһы 60 АЕ тиклем ҡуйыла.
13С маркировкаланған метаболиттар мәғлүмәттәрен анализлау. Изотоптар нисбәте мәғлүмәттәрен анализлау өсөн TraceFinder программаһын (4.2 версияһы, Термо Фишер фәнни) ҡулланыу. Һәр берләшмәнең үҙенсәлеге ышаныслы эталон берләшмәһе менән раҫланған һәм үҙ аллы анализланған. Изотоптарҙы байытыу анализын башҡарыу өсөн һәр 13С изотопының (Mn) экстракцияланған ион хроматограммаһының (XIC) майҙаны [M + H] + -нан экстракцияланған, унда n — маҡсатлы берләшмәнең углерод һаны, аминокислоталарҙы анализлау өсөн ҡулланыла йәки [ MH] + аниондарҙы анализлау өсөн ҡулланыла. XIC-тың масса теүәллеге миллионға биш өлөштән кәмерәк, ә RT-ның теүәллеге 0,05 минут тәшкил итә. Байытыу анализы асыҡланған һәр изотоптың тейешле берләшмәнең бөтә изотоптары суммаһына нисбәтен иҫәпләү юлы менән башҡарыла. Был нисбәттәр һәр изотоп өсөн процент ҡиммәттәре рәүешендә бирелә, ә һөҙөмтәләр моляр процент байытыу (МПЭ) рәүешендә бирелә, был турала элек һүрәтләнгән (42).
Туңдырылған нейрон гранулаһы боҙло һыуыҡ 80% метанолда (күләм/күләм) гомогенлаштырыла, әйләндерелә һәм -20°С температурала 30 минут инкубациялана. Өлгөһөн тағы ла әйләндереп, +4°С температурала 30 минут болғатабыҙ. Өлгө 21 000 г температурала 4°С температурала 5 минут центрифугалана, һуңынан алынған супернатант йыйыла һәм артабанғы анализ өсөн 25°С температурала SpeedVac концентраторы ярҙамында киптерелә. Үрҙә һүрәтләнгәнсә, сорттарға бүленгән күҙәнәктәрҙең аминокислоталары буйынса ЖК-МС анализы эшләнгән. TraceFinder (4.2 версияһы, Thermo Fisher Scientific) ҡулланып, мәғлүмәттәрҙе анализлау һәр берләшмәнең моноизотоп массаһын ҡулланып башҡарылған. Квантиль нормалләштереү метаболит мәғлүмәттәре preprocessCore программа пакеты ярҙамында башҡарылған (57).
Киҫәк әҙерләү. Сысҡан тиҙ углекислый газ менән наркоз һәм башын ҡырҡып, мейе тиҙ генә баш һөйәгенән сығарылған, һәм боҙ менән тултырылған вибрационный бысаҡ (HM-650 В, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Германия) ҡулланылған, уны ҡырҡып 300 375 мкм углерод се% Colgittal sa55). CO2) Түбән Са2 + АССФ (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буферы, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 һәм 6,0 мМ just Ad411 рН302 тиклем. мОсм). Алынған мейе киҫәктәрен камераға күсерергә, унда юғары Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буферы, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ рН2l2l һәм 4,0 мМ Ca3l5C. һәм 310—320 мОсм). Яҙҙырыр алдынан уларҙы тергеҙеү өсөн 20-30 минут һаҡларға кәрәк.
яҙып алыу. Бөтә яҙмалар өсөн нығытылған яҙма камера һәм 20 тапҡыр һыуға батырылған объектив линзаһы (Scientifica) менән йыһазландырылған микроскоп сәхнәһе ҡулланылған. Фаразланған Пуркинье күҙәнәктәре (i) тән ҙурлығы, (ii) баш мейеһенең анатомик урынлашыуы һәм (iii) флуоресцент mtYFP репортер генының экспрессияһы буйынса билдәләнгән. 5-тән 11 мегомға тиклем осло ҡаршылыҡлы патч пипеткаһы боросиликат быяла капилляры (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Германия) һәм горизонталь пипетка Instruments (Р-1000), СА-1000) ярҙамында сығарыла. Бөтә яҙмалар ҙа ELC-03XS npi патч-кламп көсәйткес (npi электрон GmbH, Tam, Германия) ярҙамында башҡарылған, улар Signal программаһы менән идара ителгән (версия 6.0, Кембридж электрон, Кембридж, Бөйөк Британия). Тәжрибә 12,5 кГц дискретлаштырыу тиҙлегендә теркәлгән. Сигнал 1,3 һәм 10 кГц өҙөү йышлыҡтары булған ике ҡыҫҡа үткәреүсән Бессель фильтры менән фильтрлана. Мембрана һәм пипетканың һыйҙырышлығы көсәйткес ярҙамында компенсация схемаһы менән компенсациялана. Бөтә тәжрибәләр ҙә Orca-Flash 4.0 камераһы (Хамамацу, Герден, Германия) контроле аҫтында башҡарылған, уның менән Hokawo программаһы (2.8 версияһы, Хамамацу, Герден, Германия) идара ителә.
Ғәҙәти бөтә күҙәнәк конфигурацияһы һәм анализ. Яҙҙырыр алдынан уҡ пипетканы түбәндәге матдәләрҙе үҙ эсенә алған эске иретмә менән тултырырға: 4,0 мМ КСl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭГТА, 135,0 мМ калий глюконаты, 10,0 мМ Гепес, 4,0 мМ АТФотезин)м. (Na) һәм 10,0 мМ креатинин фосфаты рН 7,25 тиклем көйләнгән, ә осмотик баҫым 290 мОсм (сахароза) тәшкил иткән. мембрана ярылыу өсөн 0 рА көс ҡулланғандан һуң шунда уҡ ял итеүсе мембрана потенциалы үлсәнә. Ҡаршылыҡ индереү -40, -30, -20 һәм -10 рА гиперполярлаштырылған токтар ҡулланып үлсәнә. Көсөргәнеш яуап күләмен үлсәү һәм Ом законын ҡулланып, инеү ҡаршылығын иҫәпләү. Спонтан эшмәкәрлек 5 минут дауамында көсөргәнеш ҡыҫҡысында теркәлгән, ә sPSC ярымавтоматик таныу сценарийы ярҙамында Игорь Pro (32 7.01 версияһы, WaveMetrics, Освего күле, Орегон, АҠШ) программаһында билдәләнгән һәм үлсәнгән. IV ҡойроғо һәм стационар ток батареяны төрлө потенциалдарҙа ҡыҫып (-110 мВ-тан башлап) һәм көсөргәнеште 5 мВ аҙымдар менән арттырыу юлы менән үлсәнә. АП етештереү деполярлаштырыусы ток ҡулланып һыналған. -70 мВ температурала күҙәнәкте ҡыҫтырырға, шул уҡ ваҡытта деполяризациялаусы ток импульсы ҡулланыла. Һәр яҙма блогының аҙым ҙурлығын айырым көйләү (10-дан 60 рА-ға тиклем). Иң юғары йышлыҡты сәбәпсе булған импульс шпиктарын ҡул менән иҫәпләп, максималь йышлыҡты иҫәпләү AP. АП сиге тәүҙә бер йәки бер нисә АП-ты эшләтеп ебәргән деполяризация импульсының икенсе сығарылышын ҡулланып анализлана.
Перфорированный патч конфигурацияһы һәм анализы. Стандарт протоколдар ҡулланып перфорированный патч яҙма башҡарыу. АТФ- һәм ГТФ-бушлай пипетка ҡулланыу, унда түбәндәге ингредиенттар юҡ: 128 мМ глюконат К, 10 мМ КСl, 10 мМ Гепес, 0,1 мМ ЭГТА һәм 2 мМ MgCl2, һәм рН 7,2 тиклем көйләү (КОН ҡулланып). Күҙәнәк мембранаһының контролһеҙ үтеп инеүсәнлеген булдырмау өсөн күҙәнәк эсендәге иретмәнән АТФ һәм ГТФ төшөрөп ҡалдырыла. Пластырь пипеткаһы амфотерицин составында эске иретмә менән тултырыла (яҡынса 200-ҙән 250 мкг/мл; G4888, Сигма-Ольдрих) перфорацияланған пластырь яҙмаһын алыу өсөн. Амфотерицин диметилсульфоксидта эретелгән (һуңғы концентрацияһы: 0,1—0,3%; ДМСО; D8418, Сигма-Ольдрих). Ҡулланылған ДМСО концентрацияһы өйрәнелгән нейрондарға һиҙелерлек йоғонто яһамаған. Перфорациялау процесында каналдың ҡаршылығы (Ra) даими күҙәтелә, Ra һәм AP амплитудаһы тотороҡланғандан һуң (20—40 минут) тәжрибә башлана. Спонтан эшмәкәрлек көсөргәнеш һәм/йәки ток ҡыҫҡысында 2-нән 5 минутҡа тиклем үлсәнә. Мәғлүмәттәрҙе анализлау Игорь Про (7.05.2 версияһы, WaveMetrics, АҠШ), Excel (2010 йылғы версияһы, Microsoft корпорацияһы, Редмонд, АҠШ) һәм GraphPad Prism (8.1.2 версияһы, GraphPad Software Inc., Ла-Холла, Калифорния штаты) программалары ярҙамында башҡарылған. АҠШ). Спонтан АП-тарҙы асыҡлау өсөн IgorPro-ның NeuroMatic v3.0c плагины ҡулланыла. Автоматик рәүештә бирелгән сикте ҡулланып АП-тарҙы билдәләү, ул һәр яҙма өсөн айырым көйләнә. Шпик интервалы ярҙамында шпик йышлығын максималь мгновенный шпик йышлығы һәм уртаса шпик йышлығы менән билдәләгеҙ.
ПН изоляцияһы. Алдан баҫылған протоколға яраҡлашып, PNs сысҡан мейеһенән билдәләнгән этапта таҙартылған (58). Ҡыҫҡаһы, мейе диссекцияланған һәм фаршланған боҙло һыуыҡ диссоциация мөхитендә [HBSS Ca2+ һәм Mg2+, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 Е/мл) һәм стрептомицин (0,05 мг/мл) менән тулыландырылған], ә һуңынан үҙләштереү · мгСС1стеин менән мгСС1стеин, papal1 / мл), папаин (16 Е / мл) һәм дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I; 0,1 мг/мл)] 30°С температурала 30 минут эшкәртергә. Тәүҙә йыуып туҡымаларҙы HBSS мөхитендә йомортҡа лайлаһы (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) һәм UNase (0,1 мг/мл) бүлмә температураһында ферментлы аш һеңдереүҙе булдырмау өсөн, ә һуңынан HBSS мөхитендә 20 мМ глюкоза), ипләп кенә шлифовка пенфильмин/HBlm5 (0,05 мг/мл) һәм ДНКаза (0,1 мг/мл) яңғыҙ күҙәнәктәрҙе сығара. Һөҙөмтәлә күҙәнәк суспензияһы аша фильтрланған 70мкм күҙәнәк фильтр, һуңынан күҙәнәктәр центрифугалау ярҙамында гранулалар (1110 rpm, 5 минут, 4°C) һәм сортлау мөхитендә ресуспендировать [HBSS, 20 мМ глюкоза һәм 20% феталь һыйыр стремилин менән тулыландырылған) Сыворотка, 20% фетал һыйыр стремицин) (0,05 мг/мл)]; пропидий йодиды менән күҙәнәктәрҙең йәшәүсәнлеген баһалау һәм күҙәнәк тығыҙлығын 1×106-нан 2×106 күҙәнәк/мл тиклем көйләү. Ағым цитометрияһына тиклем суспензияны 50 мкм күҙәнәк фильтр аша фильтрлайҙар.
Ағым цитометры. Күҙәнәктәрҙе сорттарға айырыу 4°С температурала FACSAria III машинаһы (BD Biosciences) һәм FACSDiva программа тәьминәте (BD Biosciences, 8.0.1 версияһы) ярҙамында башҡарылған. Күҙәнәк суспензияһы 100 мкм форсунка ярҙамында 20 psi баҫым аҫтында ~2800 ваҡиға/сек тиҙлеге менән сорттарға бүленгән. Традицион ҡапҡа критерийҙары (күҙәнәк ҙурлығы, бимодаль дискриминация һәм һибеү үҙенсәлектәре) ПН-ды башҡа күҙәнәк типтарынан дөрөҫ айырыуҙы тәьмин итә алмағанлыҡтан, ҡапҡа стратегияһы митоЙФП+ һәм контроль митоЙФП-ла YFP интенсивлығын һәм автофлуоресценцияһын туранан-тура сағыштырыуға нигеҙләнеп ҡуйыла. YFP өлгөнө 488 нм лазер һыҙығы менән нурландырыу юлы менән ҡуҙғытыла, ә сигнал 530/30 нм диапазонлы фильтр ярҙамында асыҡлана. MitoYFP+ ​​сысҡандарында Rosa26-mitoYFP репортер генының сағыштырмаса көсө шулай уҡ нейрон тән һәм аксон фрагменттарын айырыу өсөн ҡулланыла. 7-ААД 561 нм һары лазер менән ҡуҙғытыла һәм үле күҙәнәктәрҙе сығарыу өсөн 675/20 нм диапазонлы фильтр менән асыҡлана. Астроциттарҙы бер үк ваҡытта айырыу өсөн күҙәнәк суспензияһын ACSA-2-APC менән буяйҙар, артабан өлгө 640 нм лазер һыҙығы менән нурландырыла, сигналды асыҡлау өсөн 660/20 нм диапазонлы фильтр ҡулланыла.
Йыйылған күҙәнәктәрҙе центрифугалау юлы менән гранулалаштыралар (1110 әйләнеш/мин, 5 минут, 4°С) һәм ҡулланылғанға тиклем -80°С температурала һаҡлайҙар. Mfn2cKO сысҡандар һәм уларҙы ҡалдырған сүп-сар балалары процедура үҙгәрештәрен минималь кимәлгә еткерер өсөн бер көндә классификациялана. FACS мәғлүмәттәрен күрһәтеү һәм анализлау FlowJo программа тәьминәте ярҙамында башҡарылған (FlowJo ООО, Эшленд, Орегон, АҠШ).
Үрҙә әйтелгәнсә (59), реаль ваҡытта ПЦР ҡулланыла, ДНК айырып алыу өсөн сорттарға нейрондар өсөн артабанғы мтДНК миҡдарын билдәләү. Һыҙыҡлылыҡ һәм сик һиҙгерлеге тәүҙә төрлө һандағы күҙәнәктәрҙә qPCR үткәреү юлы менән тикшерелгән. Ҡыҫҡаһы, 50 мМ трис-НСl (рН 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20 һәм протеиназа К (200 нг/мл) торған лизис буферында 300 ПН йыйып, 55°С температурала 120 минут инкубациялайҙар. Күҙәнәктәрҙе артабан 95°С температурала 10 минут инкубациялайҙар, протеиназа К-ның тулыһынса инактивацияһын тәьмин итеү өсөн. Фән, каталог номеры Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Сайентифик, каталог номеры AIVI3E8) һәм 18S (Термо Фишер Сайентифик, каталог номеры Hs99999901_s1) гендары.
Протеом өлгөһөн әҙерләү. минут дауамында 95°C температурала йылытыу һәм ультразвук ярҙамында, лизис буферында [6 М гуанидин хлориды, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлориды, 10 мМ хлорацетамид һәм 100 мМ трис-НС пеллет туңдырылған нейрон]. минутҡа Биорупторҙа (Диагенод) (30 секунд импульс / 30 секунд пауза осоро). Өлгө 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) 1:10 нисбәтендә һыуытылған, 300 нг трипсин алтын (Promega) менән ҡатнаштырылған һәм 37°С температурала төнө буйы инкубацияланған, тулы аш һеңдереүҙе тормошҡа ашырыу өсөн. Икенсе көндө өлгөнө 20 мең г температурала 20 минут центрифугалайҙар. Супернатант 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһы менән һыуытылған, ә иретмәне үҙҙәре эшләгән StageTips менән тоҙһоҙландырғандар. Өлгө SpeedVac приборында (Эппендорф концентраторы плюс 5305) 45°С температурала киптерелә, һуңынан пептид 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһында суспензиялана. Бөтә өлгөләрҙе лә бер юлы бер кеше әҙерләгән. Астроцит өлгөләрен анализлау өсөн 4 мкг тоҙһоҙландырылған пептидтар тандем масса билдәһе (TMT10plex, каталог номеры 90110, Thermo Fisher Scientific) менән маркировкаланған, пептид һәм ТМТ реагенты нисбәте 1:20. ТМТ маркировкаһы өсөн 0,8 мг ТМТ реагенты 70 мкл һыуһыҙ АСН-да ресуспендировать ителә, ә киптерелгән пептид 9 мкл 0,1 М ТЭАБ-ҡа (триэтиламмоний бикарбонаты) ҡабаттан ҡатнаштырыла, уға АСН-да 7 мкл ТМТ реагенты өҫтәлә. Концентрацияһы 43,75% тәшкил иткән. минут инкубациянан һуң реакцияны 2 мкл 5% гидроксиламин менән һүндерәләр. Маркировкаланған пептидтар йыйыла, киптерелә, 200 мкл 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһында (ФА) ресуспендировать, икегә бүленгән, һуңынан үҙҙәре эшләгән StageTips ҡулланып тоҙһоҙландырылған. 3000 ультра юғары етештереүсәнлекле шыйыҡса хроматографы (UltiMate 3000 ультра юғары етештереүсәнлекле шыйыҡса хроматографы) ҡулланып, ике яртыһының береһе 130Å1.7мкм C18 киҫәксәләре менән тултырылған 1мм х 150мм Acquity хроматографик колонкаһында фракционлаштырылған (No Waters, каталог150). Термо Фишер фәнни). Айырым пептидтар тиҙлеге ағымы 30мкл/мин, айырым 1% 50% буфер В 85 минут аҙымлы градиент менән 96 минут, 50% 95% буфер В 3 минут, һуңынан 8 минут 95 % Буфер В; А буферы 5% АСН һәм 10 мМ аммиак бикарбонаты (АВС), ә В буферы 80% АСН һәм 10 мМ АВС. минут һайын фракциялар йыйып, ике төркөмгә (1 + 17, 2 + 18 һ.б.) берләштереп, вакуум центрифугаһында киптерергә.
ЖК-МС/МС анализы. Масс-спектрометрия өсөн пептидтар (һаны r119.aq) 25 см, 75 мкм эске диаметрлы UcoFrit аналитик колонкаһында (яңы объектив линзаһы, өлөш номеры PF7508250) 1,9 мкм ReproSil-Pur Crse, 12. EASY-nLC 1200 (Термо Фишер Сайентифик, Германия). Колонка 50°С температурала тотолған. А һәм В буферҙары һыуҙа 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһы һәм 80% АСН-да 0,1% ҡырмыҫҡа кислотаһы булып тора. Пептидтар 6% -тан 31% -ҡа тиклем В буферынан 65 минут һәм 31% -тан 50% -ҡа тиклем В буферынан 5 минут 200 нл/мин градиент менән айырыла. Элюирланған пептидтарҙы «Орбитрап Фьюжн» масс-спектрометрында («Термо Фишер Сайентифик») анализлайҙар. Пептид прекурсоры м/з үлсәү 350-нән 1500 м/з диапазонында 120 000 асыҡлыҡ менән башҡарыла. 27% нормалаштырылған бәрелеш энергияһын ҡулланып, 2-нән 6-ға тиклем заряд хәле булған иң көслө прекурсор юғары энергиялы С тоҙаҡ диссоциацияһы (HCD) ярылыуы өсөн һайлана. Цикл ваҡыты 1 с тип ҡуйыла. Пептид фрагментының m/z ҡиммәте ион тоҙаҡта иң бәләкәй AGC маҡсатлы 5×104 һәм 86 мс максималь инъекция ваҡыты ҡулланып үлсәнә. Фрагментациянан һуң прекурсорҙы 45 с дауамында динамик сығарыу исемлегенә индерәләр. 164942-се каталог номеры буйынса 50 см, 75 мкм ҙурлыҡтағы Acclaim PepMap колонкаһында ТМТ-маркировкалы пептидтар айырылған, ә миграция спектрҙары Orbitrap Lumos Tribrid масс-спектрометрында (Thermo Fisher Scientific юғары валимметрик юғары формалы) анализланған. (FAIMS) ҡорамалдары (Thermo Fisher Scientific) ике компенсация көсөргәнешендә эшләй −50 һәм −70 В. MS3 синхронлаштырыу прекурсоры нигеҙендә һайланған ТМТ отчет ион сигналын үлсәү өсөн ҡулланыла. Пептидтарҙы айырыу EASY-nLC 1200 өҫтөндә үткәрелгән, 90% һыҙыҡлы градиент элюцияһы ҡулланып, буфер концентрацияһы 6% -тан 31% -ҡа тиклем; А буферы 0,1% ФА, ә В буферы 0,1% ФА һәм 80% АСН тәшкил иткән. Аналитик колонка 50°С температурала эшләй. FreeStyle ҡулланыу (1.6 версияһы, Термо Фишер фәнни) FAIMS компенсация көсөргәнеше буйынса төп файлды бүлергә.
Аҡһымды асыҡлау һәм миҡдарын билдәләү. Интеграцияланған Андромеда эҙләү системаһын ҡулланып, тәүге мәғлүмәттәр MaxQuant 1.5.2.8 версияһы (https://maxquant.org/) ярҙамында анализланған. Aequorea victoria үҫемлегенән алынған Cre рекомбиназаһы һәм YFP эҙмә-эҙлеклелегенән тыш, пептид фрагменттары спектрҙары сысҡан эҙләнеүҙең протеомаһының канон эҙмә-эҙлеге һәм изоформа эҙмә-эҙлеге эҙләнгән (Протеом ID UP000000589, майҙа Uni102-нән күсерелгән). Метиониндың окисланыуы һәм аҡһымдың N-терминаль ацетилләшеүе үҙгәрмәй торған модификациялар булараҡ ҡуйылған; цистеин карбамоил метилләшеүе нығытылған модификациялар булараҡ ҡуйылған. Аш һеңдереүҙең параметрҙары “спецификлыҡ” һәм “трипсин/Р” тип ҡуйыла. Аҡһымды асыҡлау өсөн ҡулланылған пептидтар һәм бритва пептидтарының минималь һаны 1 тәшкил итә; уникаль пептидтар һаны минималь 0. Пептид картаһын тап килтереүҙең шарттарында аҡһымды идентификациялау тиҙлеге 0,01 тәшкил иткән. “Икенсе пептид” варианты эшләй. Ҡулланыу “йүгерә араһында тап килгән” варианты тапшырыу өсөн уңышлы идентификациялар араһында төрлө төп файлдар. Ҡулланыу LFQ минималь нисбәте иҫәп 1 өсөн ярлыҡһыҙ миҡдар (LFQ) (60). LFQ интенсивлығы һәр ваҡыт нөктәһендә кәмендә бер генотип төркөмөндә кәмендә ике дөрөҫ ҡиммәттәр өсөн фильтрлана, һәм киңлеге менән нормаль таралыуҙан экстраполяциялана. 0,3 һәм 1,8 аҫҡа күсә. Ҡулланыу Персей иҫәпләү платформаһы (https://maxquant.net/perseus/) һәм R (https://r-проект.орг/) анализлау өсөн LFQ һөҙөмтәләре. Дифференциаль экспрессив анализ өсөн limma программа пакетынан ике яҡлы уртаса t-тест ҡулланылған (61). Эксплоратор мәғлүмәттәрен анализлау ggplot, FactoMineR, фактоэкстра, GGally һәм pheatmap ҡулланып башҡарыла. 1.6.10.43 версияһы MaxQuant ҡулланып, ТМТ нигеҙендәге протеомик мәғлүмәттәр анализланды. Эҙләү сеймал протеомика мәғлүмәттәре UniProt’s кеше протеомика базаһы, был скачать сентябрь 2018. Анализ етештереүсе тарафынан бирелгән изотоп таҙалыҡ төҙәтеү факторы инә. Дифференциаль экспрессив анализ өсөн R-ҙа лимма ҡулланыу. Тәүге мәғлүмәттәр, мәғлүмәттәр базаһында эҙләү һөҙөмтәләре, мәғлүмәттәрҙе анализлау эш ағымы һәм һөҙөмтәләре барыһы ла ProteomeXchange альянсында PRIDE партнер һаҡлағысы аша мәғлүмәттәр йыйылмаһы идентификаторы PXD019690 менән һаҡлана.
Функциональ аннотациялар анализды байыта. аҙнала мәғлүмәттәр йыйылмаһының функциональ аннотация шарттарының байлығын билдәләү өсөн анализ юлының тапҡырлыҡ (QIAGEN) инструменты ҡулланылған (1-се һүрәт). Ҡыҫҡаһы, LC-MS/MS (тандем масс-спектрометрия) мәғлүмәттәрен анализлауҙан алынған миҡдарлы аҡһым исемлеге түбәндәге фильтр критерийҙары менән ҡулланыла: Mus musculus төрҙәре һәм фоны булараҡ һайлана, ә категория күрһәтә Р ҡиммәте Benjamini тарафынан байытыу өсөн көйләнгән 0,05 йәки түбәнерәк әһәмиәтле тип иҫәпләнә. Был график өсөн һәр кластерҙа көйләнгән Р ҡиммәтенә нигеҙләнгән биш артыҡ категория күрһәтелгән. Күп тапҡыр t-тест ҡулланып, Бенджамини, Кригер һәм Екутиелиның ике этаплы һыҙыҡлы күтәреү программаһын ҡулланып (Q = 5%), һәр категорияла билдәләнгән мөһим кандидаттарҙа ваҡыт үткән һайын аҡһым экспрессияһын анализлау үткәрелә, ә һәр рәт айырым анализлана. Эҙмә-эҙлекле СД ҡабул итеү кәрәкмәй.
Был тикшеренеүҙең һөҙөмтәләрен баҫылған мәғлүмәт базалары менән сағыштырыу һәм 1-се һүрәттәге Венн диаграммаһын генерациялау маҡсатында беҙ миҡдарлы аҡһым исемлеген MitoCarta 2.0 аннотациялары менән берләштерҙек (24). Ҡулланыу онлайн-инструмент һыҙырырға Венн диаграммаһы (http://биоинформатика.psb.ugent.be/webtools/Венн/) диаграмма генерациялау өсөн.
Протеомик анализ өсөн ҡулланылған статистик процедуралар тураһында тулыраҡ мәғлүмәт алыу өсөн, рәхим итеп, тейешле бүлеккә мөрәжәғәт итегеҙ Материалдар һәм ысулдар. Ҡалған бөтә тәжрибәләр өсөн ентекле мәғлүмәтте тейешле легендала табырға мөмкин. Әгәр башҡаса күрһәтелмәһә, бөтә мәғлүмәттәр уртаса ± SEM тип күрһәтелә, һәм бөтә статистик анализдар GraphPad Prism 8.1.2 программа тәьминәте ярҙамында башҡарылған.
Был мәҡәлә өсөн өҫтәмә материалдарҙы ҡарағыҙ:
Был асыҡ рөхсәт мәҡәләһе Creative Commons атрибуция-коммерцияға ҡарамаған лицензия шарттары буйынса таратыла, был теләһә ниндәй сараларҙа ҡулланыу, таратыу һәм ҡабатлау мөмкинлеген бирә, әгәр ҙә һуңғы ҡулланыу коммерция файҙаһы өсөн түгел һәм премия булып тора, тип, төп эш дөрөҫ. Һылтанма.
Иҫкәрмә: Беҙ һеҙҙең электрон почта адресығыҙҙы бирергә генә һорайбыҙ, һеҙ биткә кәңәш иткән кеше белә, һеҙ уларҙы күрергә теләйем, электрон почта һәм был спам түгел. Беҙ бер ниндәй ҙә электрон почта адрестарын тотмаясаҡбыҙ.
Был һорау һеҙҙең ҡунаҡ булыуын тикшерергә һәм автоматик спам тапшырыуҙы булдырмау өсөн ҡулланыла.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактхивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональ нейрондарҙы протеомик анализлау нейродегенерацияға ҡаршы тороу өсөн метаболизм программаларының әүҙемләшеүен асыҡлай.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактхивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональ нейрондарҙы протеомик анализлау нейродегенерацияға ҡаршы тороу өсөн метаболизм программаларының әүҙемләшеүен асыҡлай.
©2020 Америка фәнде үҫтереүҙең ассоциацияһы. бөтә хоҡуҡтары һаҡлана. АААС — ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф һәм КАУНТЕР компанияларының партнеры. 2375-2548 ISSN.