Хәҙерге†Ағымдағы адресы: OX11 0DE, Бөйөк Британия, Алмаз бинаһы, Харвелл фән һәм инновациялар паркы, Диеткот, Оксфордшир, Бөйөк Британия, Алмаз яҡтылыҡ сығанағы Co., Ltd., Электрон биологик һүрәт төшөрөү үҙәге.
Реакция үҙәге яҡтылыҡ йыйыу комплексы 1 (RC-LH1) — ҡыҙыл төҫтәге фототроф бактерияларҙағы төп фотосинтез компоненты. Беҙ RC-LH1 комплексының ике криоэлектрон микроскопия структураһын индерҙек. RC-LH114-W комплексының 2,65 Å асыҡлыҡ структураһы RC-ны уратып алған 14 субъединица LH1 иллюминаторынан тора, улар W аҡһымы менән өҙөлә, ә W аҡһымһыҙ комплекс тулыһынса RC составы менән уратып алынған. Ябыҡ 16 субъединица LH1 петля. Был структураларҙы сағыштырыу RC-LH1 комплексында хинон динамикаһы тураһында төшөнсә бирә, шул иҫәптән RC QB сайтында хинонды бәйләгәндә быға тиклем билдәләнмәгән конформацион үҙгәрештәр, шулай уҡ ярҙамсы хинон бәйләү урындарының урынлашыуы, уларҙы RC-ға тапшырырға ярҙам итә. W аҡһымының үҙенсәлекле төҙөлөшө LH1 иллюминаторының ябылыуына ҡамасаулай, шуның менән хинон/хинолон алмашыныуын тиҙләтеү өсөн канал барлыҡҡа килә.
Фотосинтез ярҙамында бирелгән энергия ерҙәге бөтә тереклекте тиерлек тота ала, ҡояш биотехнологияһы өсөн ҙур мөмкинлектәргә эйә. Глобаль фотосинтезға булышлыҡ итеү менән бер рәттән, ҡыҙыл төҫтәге фототроф бактериялар шулай уҡ төрлө энергетик режимдар һәм матдәләр алмашыныуы мөмкинлектәрен күрһәтә. Улар фотосинтездан ҡасып, ҡараңғыла гетеротроф бактериялар булып үҫә ала, азот һәм углекислый газды нығыта ала, водород етештерә, хуш еҫле берләшмәләрҙе тарҡата ала (1—3). Был процестарҙы энергия менән тәьмин итеү өсөн яҡтылыҡты тиҙ һәм һөҙөмтәле химик энергияға әйләндерергә кәрәк. Был процесс яҡтылыҡты тотоусы антенна комплексы яҡтылыҡты үҙләштергәндә һәм тоҙаҡҡа эләккән энергияны реакция үҙәгенә (РС) тапшырғанда башлана, шуның менән заряд айырыу башлана (4 – 7). Фиолетовый фототроф бактерияларҙа фотосинтездың төп берәмеге 2-се типтағы РК-нан тора, уларҙы яҡтылыҡ йыйыусы 1-се комплекс (LH1) уратып алған, РК-LH1 ядро ​​комплексын барлыҡҡа килтерә. LH1 кәкре αβ гетеродимерҙары массивынан барлыҡҡа килә, улар һәр береһе ике бактериаль хлорофилл (BChl) а молекулаһын һәм бер-ике каротиноидты бәйләй (8—12). Иң ябай LH1 антеннаһы состоит из 16 йәки 17 αβ гетеродимеры уратып RC (9-13) ябыҡ иллюминатор, әммә башҡа ядро ​​комплекстарында, трансмембранный пептидтар өҙлөкһөҙлөктө өҙөп тирә-яҡ LH1 , Шул рәүешле булышлыҡ итеү хинол/хинон диффузия араһында bRCmex1. 13—15). Фиолетовый фототроф үҫемлек Rhodopseudomonas (Rps.) — фотосинтезға булышлыҡ итеүсе энергия һәм электрон тапшырыуҙы аңлай алған модель организм. Рпс-тың беренсе кристаллы төҙөлөшө. Palustris RC-LH1 комплексының моделе RC булып тора, 15 гетеродимер LH1 иллюминаторы менән уратып алынған, уларҙы “W аҡһымы” тип аталған билдәһеҙ аҡһым өҙөп тора (14). Аҡһым-W артабан RPA4402 тип билдәләнде, был характеристикаһыҙ 10.5кДа аҡһым менән өс күҙаллана трансмембранный спираль (ТМН) (16). Беҙ rpa4402 генын кодлаусы аҡһым W-ны pufW тип үҙгәртергә тәҡдим итәбеҙ, был RC-L, M (pufL, pufM) һәм LH1α, β (pufA, pufB) субъединицаларын кодлаусы гендар өсөн ҡулланылған номенклатураға ярашлы булһын өсөн. Ҡыҙыҡ, аҡһым-W тик яҡынса 10% RC-LH1, асыҡлау Rps. palustris ике төрлө RC-LH1 комплексын етештерә. Бында беҙ ике ядро ​​комплексының юғары асыҡлыҡтағы крио-ЭМ (крио-ЭМ) структуралары тураһында хәбәр итәбеҙ, береһе W аҡһымы һәм 14 αβ гетеродимеры, икенсеһе W аҡһымһыҙ һәм ябыҡ 16 Гетеродимер LH1 иллюминаторы. Беҙҙең структура Rps RC-LH1 комплексын аңлауҙа аҙым үҙгәрешен күрһәтә. palustris, сөнки беҙ һәр варианттың бер төрлө популяцияһын анализланыҡ һәм һәр пептидты һәм бәйләнгән пигменттарҙы һәм улар менән бәйле липидтарҙы һәм хинондарҙы аныҡ билдәләү өсөн етерлек асыҡлыҡҡа эйәбеҙ. Был структураларҙы сағыштырыу күрһәтеүенсә, әлегә тиклем башҡа бер ниндәй ҙә RC-LH1 комплексында табылмаған өс ТМН аҡһымы-W хинон/хинолон алмашыныуын тиҙләтеү өсөн хинон каналын генерациялай. Ҡайһы бер консервацияланған липидтар һәм хинондарҙы бәйләү урыны асыҡланған, һәм беҙ хинон һәм РК-ны берләштергәндән һуң яңы конформацион үҙгәреште асыҡланыҡ, ул кислородлы фототроф организмдарҙағы фотосистема II (PSII) РК-һы өсөн яраҡлы булыуы мөмкин. Беҙҙең табыштар хинон/хинолон бәйләү һәм алмашыу кинетикаһы тураһында яңы төшөнсәләр бирә RC-LH1 ядро ​​комплексында ҡыҙыл фототроф бактериялар.
Рпс-та табылған ике комплексты ентекле өйрәнеүҙе еңеләйтеү маҡсатында. palustris, беҙ һәр RC-LH1 биохимик ысулдар менән айырып алабыҙ. W-дефицитлы аҡһым комплексы (артабан ΔpufW тип атала) pufW гены булмаған штаммдан таҙартылған (16), һәм бер генә RC-LH1 комплексы етештерергә мөмкин. W аҡһымлы комплекс штамм ярҙамында етештерелә. Был штаммдың W аҡһымы үҙенең С-осонда 10x His билдәһе менән үҙгәртелә, шуға күрә W аҡһымы составындағы комплексты металлды иммобилизациялау юлы менән иң етешмәгән W аҡһымы менән һөҙөмтәле берләштерергә мөмкин. Комплекс һөҙөмтәле айырыла (16) Яҡынлыҡ хроматографияһы (IMAC).
1-се һүрәттә күрһәтелгәнсә, ике комплекста ла LH1 антеннаһы менән уратып алынған өс подблок RC (RC-L, RC-M һәм RC-H) бар. 2,80-А структураһы комплексы етешмәй аҡһым-W күрһәтә 16 αβ гетеродимер, ябыҡ LH1 иллюминатор барлыҡҡа килтерә, тулыһынса RC тирәләй, артабан RC-LH116 комплексы тип атала. Аҡһым-W составындағы комплекстың 2,65 Å структураһында аҡһым-W менән өҙөлгән 14 гетеродимер LH1 бар, артабан RC-LH114-W тип атала.
(А һәм В) Ҡатнашманың өҫкө өлөшөн күрһәтеү. (С һәм D) таяҡсаларҙа экспрессияланған бәйләнгән пигменттар. (Е һәм F) Цитоплазма өҫтөнән күҙәтелгән комплекстарҙа йәнһүрәттәрҙә күрһәтелгән пептидтар һәм LH1 субберәмектәре бар, улар аҡһым-W арауығынан сәғәт йүнәлеше буйынса һанланған [Rba һанлау менән тап килә]. сфероидтар комплексы (13)]. LH1-α өсөн аҡһым субблокының төҫө һары; LH1-β өсөн аҡһым субблогының төҫө күк; аҡһым-W өсөн аҡһым ҡыҙыл төҫтә; RC-H өсөн ул лазурит; RC-L өсөн ул — Оранжевый; RC-M өсөн, пурпурный. Кофакторҙар таяҡсалар менән күрһәтелә, йәшел төҫтә BChl һәм BPh a молекулалары, ҡыҙыл төҫтә каротиноидтар, һары төҫтә UQ10 молекулалары күрһәтелә. (G һәм H) RC-LH114-W комплексы (G) һәм RC-LH116 комплексы (H) эквивалентлы төбәгендә аҡһым-W айырмаһының ҙурайтылған күренеше. Кофакторҙар арауыҡты тултырыу рәүешендә күрһәтелә, хелатлы хинон зәңгәр төҫтә күрһәтелә. Аҡһым-W арауығы зәңгәр һыҙыҡлы һыҙыҡ менән айырылып тора (G), ә бәләкәй тишектәр, унда хинон/хинолол диффузияһы LH116 йөҙөгө ҡара һыҙыҡлы һыҙыҡ менән айырылып тора (H).
1-се һүрәттә (А һәм В) LH1αβ гетеродимерҙарының асыҡ йәки ябыҡ массивтары менән уратып алынған РК күрһәтелгән, улар һәр береһе ике BChl һәм бер каротиноидты бәйләй (1-се һүрәттә, С һәм D). Алдағы тикшеренеүҙәр Rps LH1 комплексы булыуын күрһәткән. Спирулина ксантинының биосинтез юлында был төрҙәрҙә каротиноидтар ҡатнаш популяциялары бар (17). Әммә спиропирроксантин өҫтөнлөклө каротиноид булып тора һәм уның тығыҙлығы ҡәнәғәтләнерлек. Шуға күрә беҙ бөтә LH1 бәйләү урындарында спироксантинды моделләштереүҙе һайланыҡ. Альфа һәм бета полипептидтар ҡыҫҡа мембраналы тышҡы төбәктәре булған яңғыҙ ТМХ-лар булып тора (1-се һүрәт, А, В, Е һәм F). С-осонда 17 ҡалдыҡтың тығыҙлығы күҙәтелмәһә лә, ике комплекста ла альфа-полипептид Met1-ҙән Ala46-ға тиклем ярылған. β полипептид RC-LH116-ла Gly4-тән Tyr52-гә тиклем, ә RC-LH114-W-ла Ser5-тән Tyr52-гә тиклем кәметелгән. йәки 4 N-терминаль йәки 13 С-терминаль ҡалдыҡтар тығыҙлығы күҙәтелмәгән (S1 һүрәте). Ҡырағай типтағы штаммдан әҙерләнгән ҡатнаш RC-LH1 комплексын масс-спектрометрия анализы юғалған төбәктең был пептидтарҙы гетероген ярылыу һөҙөмтәһе булыуын күрһәтте (S1 һәм S2 һүрәттәре). α-Met1-ҙең N-терминаль формилләшеүе лә күҙәтелә (f). Анализ күрһәтеүенсә, α-пептид fMet1 ҡалдыҡтарынан Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ҡалдыҡтарынан, ә β-пептид Ser2 ҡалдыҡтарынан Ala53 ҡалдыҡтарынан тора, был түбән температуралы ЭМ тығыҙлығы картаһы менән яҡшы килешә.
α-His29 һәм β-His36 координацияһы БЧл-дарҙы йөҙгә-йөҙ осрата; һәр αβ гетеродимеры күршеләре менән йыйылып, асыҡ иллюминатор (RC-LH114-W) йәки ябыҡ иллюминатор (RC-LH116) барлыҡҡа килтерә RC тирәләй Экситондар менән бәйләнгән пигмент массивы (1-се һүрәт, С һәм D). 877 нм диапазоны менән сағыштырғанда RC-LH114-W, 880 нм абсорбция ҡыҙыл смена RC-LH116 3 нм (һүрәт 2А). Әммә түңәрәк дихроизм спектры бер үк тиерлек (2-се һүрәт, В), был асыҡ һәм ябыҡ иллюзиялар араһында асыҡ айырма булһа ла, БХл-дар урындағы мөхите бик оҡшаш булыуын күрһәтә. Һеңдереүҙең ҡыҙыл һыҙаттары ябыҡ иллюминаторҙа йылылыҡ хәрәкәтенең кәмеүе һәм тотороҡлолоҡтоң артыуы (18, 19), ябыҡ иллюминатор арҡаһында пигмент бәйләнешенең үҙгәрелеүе (20, 21) йәки был ике эффекттың берләшмәһе (11) һөҙөмтәһе булыуы мөмкин.
(А) Ультрафиолет/күренгән/яҡын инфраҡыҙыл абсорбция спектры, уларҙы тейешле пигменттар менән билдәләнгән һәм 775 нм-ҙа BPh пигына тиклем нормалаштырылған. (Б) Түңәрәк дихроизм спектры нормалаштырылған BChl абсорбцияһы 805 нм. (С һәм D) Һайланған ΔA спектрҙары ваҡыт менән хәл ителгән абсорбция спектрҙары RC-LH114-W комплексы (С) һәм RC-LH116 комплексы (D). Яҡшыраҡ сағыштырыу өсөн бөтә спектрҙар 0,2 пс-та −A-ның ∆A-һына тиклем нормалаштырыла. (Е) тиҙлеге цитохром с2 окисланыу нурланыштан һуң төрлө концентрацияһы булғанда UQ2 (ҡара: һүрәт S8 сеймал мәғлүмәттәре өсөн). (F) күҙәнәктәрҙә үҫтерелгән түбән, уртаса йәки юғары интенсивлыҡтағы яҡтылыҡ (10, 30 йәки 300мкМм-2 с-1, ярашлы рәүештә), аҡһым W һәм RC-L субъединицалары таҙартылған комплекста һәм айырылған мембрана нисбәте. Аҡһым кимәлен SDS-полиакриламид гель электрофорезы һәм иммуноанализ ярҙамында билдәләү (сеймал мәғлүмәттәре өсөн S9 һүрәтен ҡарағыҙ). Таҙартылған RC-LH114-W комплексына ҡарата нисбәтте билдәләү. RC-L һәм комплекстың аҡһым-W стехиометрик нисбәте 1:1 тәшкил итә.
1-се позициялағы BChls деформированный αβ14 иллюминатор RC-LH114-W (һүрәт 1, А, С, һәм Е) яҡыныраҡ RC беренсел донор (Р) 6.8Å ҡарағанда эквивалентлы BChls RC-LH116 (һүрәт. 1, В һәм S3); әммә ике комплекстың ваҡытлыса һеңдерелеү кинетикаһы күрһәтеүенсә, RC-LH114-W һәм RC-LH116 өсөн LH1-ҙән RC-ға тиклем ҡуҙғытыу энергияһын тапшырыу ваҡыты константалары 40 ±4 һәм 44±3 ps тәшкил итә (2-се һүрәт). , C һәм D, һүрәт S4 һәм таблица S2). Шулай уҡ RC эсендә электрон тапшырыуҙа һиҙелерлек айырма юҡ (S5 һүрәте һәм уға бәйле өҫтәмә текст). Беҙ шикләнәбеҙ, LH1 һәм RC-P араһындағы энергия тапшырыу ваҡытының тығыҙ тап килгәнлеге ике LH1 иллюминаторында күпселек BChl-дың оҡшаш арауығы, мөйөшө һәм потенциаль энергияһы менән бәйле. Минималь арауыҡҡа етеү өсөн LH1 энергия схемаһын тикшергәндә субоптималь урындарҙан РК-ға туранан-тура энергия тапшырыуҙан тиҙерәк түгел кеүек. RC-LH114-W асыҡ иллюминаторлы LH1 иллюминаторы структур анализ өсөн түбән температура шарттарында ла әһәмиәтһеҙ термик хәрәкәт кисерә ала, ә бүлмә температураһында RC 1 позицияһында βBChls пигментация арауығынан оҙонораҡ αβ14 йөҙөк конформацияһы бар.
RC-LH116 комплексында 32 БЧл һәм 16 каротиноид бар, уның дөйөм урынлашыуы Термохроматий (Тч.) пидпидум [Аҡһым мәғлүмәттәре банкы (PDB) ID 5Y5S (9), Тиорходовибрион IDDC7T9r (9), Тиорходовибрион IDC7T9r. (12) һәм йәшел һыу үләндәре (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Һуң тура килтереп, αβ гетеродимерҙары позицияларында тик бәләкәй генә тайпылыштар күҙәтелә, бигерәк тә 1-5, 15 һәм 16 (S6 һүрәте). Аҡһым-W булыуы LH1 төҙөлөшөнә ҙур йоғонто яһай. Уның өс ТМХ-һы ҡыҫҡа иллюминаторҙар менән тоташтырылған, комплекстың люмен яғында N-терминалы, цитоплазма яғында С-терминалы (1А һәм 3-сө һүрәттәр, А-нан D-ға тиклем). Аҡһым-W күпселек осраҡта гидрофоб (3-сө һүрәт В), ә TMH2 һәм TMH3 LH1αβ-14 менән үҙ-ара тәьҫир итешеп, трансмембраналы өҫтө барлыҡҡа килтерә (3-сө һүрәт, В һәм Е-нан G-ға тиклем). Интерфейс башлыса трансмембраналы өлкәләге Phe, Leu һәм Val ҡалдыҡтарынан тора. Был ҡалдыҡтар гидрофоб аминокислоталар һәм αβ-14 пигменттары менән өйөлгән. Ҡайһы бер поляр ҡалдыҡтар ҙа үҙ-ара тәьҫир итешеүгә булышлыҡ итә, шул иҫәптән ҡатмарлы ҡыуышлыҡ өҫтөндәге W-Thr68 һәм β-Trp42 араһындағы водород бәйләнеше (3-сө һүрәт, F һәм G). Цитоплазма өҫтөндә Gln34 αβ-14 каротиноидтарының кето төркөмө менән йәнәш тора. Бынан тыш, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекулаһы хәл ителә, уның гидрофоб ҡойроғо аҡһым-W һәм αβ-14 араһындағы интерфейсҡа тиклем һуҙылған, ә липид ҡойроғо организмда урынлашыуы ихтимал. Беҙ шулай уҡ иғтибар иттек, тип C-терминаль асыҡлау төбәктәре аҡһым W һәм RCH бик яҡын, әммә махсус үҙ-ара тәьҫир итешеүҙәр формалаштырыу сиктәрендә түгел (һүрәт 1, А һәм Е). Әммә был ике аҡһымдың хәл ителмәгән С-терминаль аминокислоталарында үҙ-ара тәьҫир итешеүҙәр булыуы мөмкин, улар RC-LH114-W комплексын йыйыу ваҡытында аҡһым-W-ны йыйыу механизмын тәьмин итеүе мөмкин.
(А) Аҡһым-W, был йөҙө менән интерфейс LH1αβ14 йәнһүрәт формаһында, штанга формаһындағы ян сылбыр (ҡыҙыл), электростатик потенциал диаграммаһының бер өлөшөндә күрһәтелгән (үтә күренмәле һоро өҫтө контур кимәле 0,13). (Б) Аҡһым-W гидрофоб төҫлө өҫтө менән күрһәтелгән. Поляр һәм зарядлы урындар лазурит төҫөндә, гидрофоб урындар аҡ, көслө гидрофоб урындар һорғолт төҫтә күрһәтелгән. (С һәм D) Аҡһым-W йәнһүрәттә күрһәтелгән, уның йүнәлеше (А) (С)-тағы кеүек үк, 180° (D) әйләндерелә. Эҙмә-эҙлеклелектәге урынлашыу буйынса айырылып торған ҡалдыҡтар йондоҙлоҡ төҫтәр схемаһын ҡабул итә, унда N-терминал күк, С-терминал ҡыҙыл төҫтә була. (Е) Аҡһым-W шул уҡ күренештә (А), һәм ҡалдыҡтар интерфейсында аҡһым-W:LH1 таяҡсалар менән күрһәтелгән беркетелгән билдәләр. (F) Аҡһым-W әйләндерелә 90° сағыштырмаса (E) һәм LH1αβ14 йәнһүрәт күрһәтеүендә, һәм интерфейс ҡалдыҡтарына ҡарата штанга күрһәтеүендә. Бета-полипептидтан өҫкә ҡалҡып торған ҡалдыҡтар маркировкалана. Кофактор 1-се һүрәттәге төҫкә тап килгән һыҙыҡ рәүешендә күрһәтелгән, тарҡалған β-ДДМ һоро төҫтә, ә кислород ҡыҙыл төҫтә күрһәтелгән. (G) (F)-тәге күренеш 180° әйләндерелә, унда альфа-полипептидтың маркировкаланған ҡалдыҡтары күренеп тора.
Аҡһым-W αβ гетеродимерын (1F һүрәттәге 15-сеһе) алмаштыра, шуның менән иллюзияның ябылыуына һәм тәүге өс αβ гетеродимерының эйелеүенә юл ҡуймай. Күҙәтелгән, тип максималь эйелеү мөйөшө беренсе αβ-1 гетеродимер ҡарата пленка нормаль 25° 29° (һүрәт 1, А һәм Е), был барлыҡҡа килгән 2° 8° эйелеү αβ-1 RC А ҡырҡа контраст-LH116 andF (һүрәт 1, В). Икенсе һәм өсөнсө гетеродимерҙар ярашлы рәүештә 12°-тан 22°-ҡа тиклем һәм 5°-тан 10°-ҡа тиклем эйелгән. RC стерик ҡамасаулау арҡаһында, эйелеү αβ-1 икенсе пар αβ үҙ эсенә алмай (был тура килә 16-сы αβ һүрәттә 1F), шулай итеп, асыҡ арауыҡ барлыҡҡа килтерә LH1 йөҙөк (һүрәт 1, А һәм Е) . Ике αβ гетеродимеры булмау сәбәпле, дүрт BChl һәм ике каротиноидтың юғалыуы менән бергә, каротиноидтарҙан берәү ҙә боролошло αβ-1 субблогына бәйләнмәй, һөҙөмтәлә LH114-W йөҙөгө барлыҡҡа килә, унда 13 каротиноид Вегетариан һәм 28 BChl бар. αβ1 7 төбәктәрҙәге ике комплекстың урындағы асыҡлыҡ баһалары ҡалған LH1 иллюминаторына ҡарағанда түбәнерәк, был RC QB сайтына эргәләш LH1 субъединицаһының үҙенсәлекле пластичлығын сағылдырырға мөмкин (4-се һүрәт) .
Һүрәттәр RC-LH114-W (А һәм В) һәм RC-LH116 (С һәм D) күрһәтелгән бер үк өҫкө ҡараш/ян ҡараш (А һәм В) (А һәм С) һәм ҡыуышлыҡ өҫтө һүрәт. 1. (В һәм D). Төҫлө асҡыстар уң яҡта күрһәтелгән.
1:14 стехиометрик нисбәтендәге берҙән-бер башҡа үҙенсәлекле ядро ​​комплексы — родококк сфероидтар (Rba.) RC-LH1-PufX димеры (13). Әммә W һәм PufX аҡһымдарының асыҡ гомологияһы юҡ, улар үҙҙәренең тейешле LH1 структураларына ҙур йоғонто яһай. PufX — N-терминаль цитоплазма домены булған берҙән-бер ТМН, ул RC-H субъединицаһының (13) цитоплазма яғы менән Rps-ҡа тап килгән позицияла үҙ-ара тәьҫир итә. 116αβ-16. PufX RC-LH1 һәм цитохром bcl комплексы араһында хинон/хинолон алмашыныуы өсөн канал булдыра һәм бөтә Rba-ла ла бар. сфероидтар үҙәк комплексы (13). Мономер-мономер интерфейсы Rba-ла булһа ла. Сфероидтар RC-LH1-PufX димеры RC-LH114-W-ла W аҡһымының бәйләү позицияһында урынлашҡан, ә PufX һәм W аҡһымы индуцированный арауыҡ эквивалентлы позицияла урынлашҡан (S7A һүрәте). RC-LH114-W-лағы айырма шулай уҡ Pseudomonas rosea LH1-ҙең гипотезалы хинон каналы (8) менән тура килә, ул W йәки PufX аҡһымы менән бәйле булмаған пептидтар ярҙамында барлыҡҡа килә (S7B һүрәте). Бынан тыш, хинон каналы Blc. Бер γ субъединицаһын сығарып барлыҡҡа килгән зөбәржәт йәшел LH1 (7) ошондай уҡ позицияла урынлашҡан (S7C һүрәте). Төрлө аҡһымдар аша медиацияланһа ла, был хинон/хинол каналдарының RC-LH1 комплексында дөйөм позицияла барлыҡҡа килгәне конвергент эволюция миҫалы булып тора кеүек, был W аҡһымы тарафынан булдырылған айырманың хинон каналы булып эшләүе мөмкинлеген күрһәтә.
LH114-W иллюминаторындағы арауыҡ RC-LH114-W комплексының эске киңлеге менән күләмле мембрана араһында өҙлөкһөҙ мембраналы өлкә барлыҡҡа килтерергә мөмкинлек бирә (1-се һүрәт Г), ә ике доменды аҡһымдарҙағы кеүек аҡһым пораһы аша тоташтырыу түгел. RC-LH116 комплексы ябыҡ Tch-ға оҡшаш. Энәгә оҡшаш комплекс (22) (1Н һүрәте). Хинондың мембрана аша диффузияһы тар аҡһым каналы аша диффузияға ҡарағанда тиҙерәк булғанлыҡтан, асыҡ LH114-W иллюминаторы ябыҡ LH116 иллюминаторына ҡарағанда тиҙерәк RC әйләнешенә мөмкинлек бирә ала, ә хинондың RC-ға диффузияһы сикләнгәнерәк булыуы мөмкин. W аҡһымының RC аша хинондарҙы үҙгәртеп ҡороуға йоғонто яһауын тикшерер өсөн беҙ убихинон 2 (UQ2) (UQ2) (тәбиғи UQ10 аналогы ҡыҫҡараҡ изопрен ҡойроғо менән) билдәле бер концентрацияһында цитохром окисланыу анализы үткәрҙек (2Е һүрәте). Хелатлы хинондың булыуы күренеп торған Михаэлис константаһын аныҡ билдәләүгә ҡамасаулай булһа ла (RC-LH114-W һәм RC-LH116 ярашлы рәүештә 0,2±0,1мкМ һәм 0,5±0,2мкМ өсөн яраҡлы), RC-LH114-114-114-114-100 максималь тиҙлеге RC-LH114-114-0. 28±5% ҙурыраҡ RC-LH116 (3,6±0,1 е-RC-1 с-1).
Беҙ тәүҙә баһалау, тип аҡһым-W бар яҡынса 10% ядро ​​комплексы (16); бында, занятость ставкалары түбән яҡтылыҡ, уртаса яҡтылыҡ, һәм юғары яҡтылыҡ үҫеш күҙәнәктәре 15±0.6%, 11±1% һәм 0.9±0.5, ярашлы рәүештә % (һүрәт 2F). Масс-спектрометрияның миҡдарлы сағыштырыуы күрһәтеүенсә, гистидин билдәһе өҫтәү ҡырағай типтағы штаммдар менән сағыштырғанда аҡһым-W-ның сағыштырмаса күплеген кәметмәй (Р = 0,59), шуға күрә был кимәлдәр үҙгәртелгән аҡһым-W-ның артефакты түгел (S10 һүрәте). Әммә был түбән занятость аҡһым-W RC-LH1 комплексында ҡайһы бер RCs тиҙләтелгән темпта әйләндерергә мөмкинлек бирә ала, шуның менән RC-LH116 комплексында яйыраҡ хинон/хинолон алмашыныуҙы йомшарта. Беҙ иғтибар иттек, юғары яҡтылыҡ занятость ставкаһы менән тура килмәй, һуңғы транскриптомия мәғлүмәттәре, был күрһәтә, тип pufW ген экспрессияһы көслө яҡтылыҡ аҫтында арта (һүрәт S11) (23). pufW транскрипцияһы һәм RC-LH1 комплексына аҡһым-W индереү араһындағы айырма буталсыҡ һәм аҡһымдың ҡатмарлы көйләүен сағылдырыуы ихтимал.
RC-LH114-W-ла 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерин (POPG) һәм 29 β-DDM молекулаһы бүленә һәм унда 6 CDL, 24 POPC, 2 PODDM һәм 12 моделләштерелә. RC-LH116 (5-се һүрәт, А һәм В). Был ике структурала CDL комплекстың цитоплазма яғында тиерлек урынлашҡан, ә POPC, POPG һәм β-DDM күбеһенсә люминаль яғында урынлашҡан. Ике липид һәм йыуыу молекулалары αβ-1 αβ-6 төбәгендә айырылған RC-LH114-W комплексы (һүрәт 5А), һәм биш эквивалентлы төбәктә айырылған RC-LH116 (һүрәт 5В ). Комплекстың икенсе яғында күберәк липидтар табылған, башлыса CDL, RC һәм αβ-7 араһында тупланған αβ-13 (5-се һүрәт, А һәм В). Башҡа структур хәл ителгән липидтар һәм йыуыу саралары LH1 йөҙөгөнән ситтә урынлашҡан, ә яҡшы хәл ителгән ацил сылбырҙары LH1 субъединицалары араһында һуҙыла, RC-LH114-W-ла β-DDM тип алдан билдәләнгән һәм RC-ла β-DDM тип билдәләнгән A ҡатнашмаһы βPOPC-DHD16. Беҙҙең структурала хелатлы липидтар һәм йыуыу сараларының оҡшаш позициялары улар физиологик яҡтан мөһим бәйләү урындары булыуын күрһәтә (S12A һүрәте). Тч-ла эквивалент молекулалар позициялары ла яҡшы эҙмә-эҙлеклелеккә эйә. Йәмле һәм Трв. 970 штамм RC-LH1s (һүрәт S12, В тиклем Е) (9, 12) һәм водород-бәйләүсе ҡалдыҡтар липид баш төркөмө ярайһы уҡ яҡшы һаҡлау күрһәтте эҙмә-эҙлеклелек тура килтереп (һүрәт S13), күрһәтеүенсә, һаҡланған CDL, тип бәйләй RC (24), был сайттарҙа comp- HRCx булыуы мөмкин.
(А һәм В) RC-LH114-W (А) һәм RC-LH116 (В) пептидтар йәнһүрәттәр менән күрһәтелгән, ә пигменттар таяҡсалар менән күрһәтелгән, 1-се һүрәттәге төҫтәр схемаһын ҡулланып. RC QA һәм QB сайттарына бәйле UQ һары төҫтә, ә айырымланған UQ күк төҫтә. (С һәм D) (А) һәм (В) кеүек үк ҡараштар, липидтар төшөрөп ҡалдырылған. (Е тиклем G) RC-LH116-нан Q1(Е), Q2(F) һәм Q3(G) ҙурайтылған күренеш, бер-береһенә йоғонто яһаған ян сылбырҙары менән. Водород бәйләнештәре ҡара һыҙыҡлы һыҙыҡтар рәүешендә күрһәтелгән.
RC-LH116-ла зарядты айырыу процесында электрондар тапшырыуҙа ҡатнашҡан RC QA һәм QB UQ икеһе лә үҙҙәренең бәйләү урындарында тарҡала. Әммә RC-LH114-W, QB хинон хәл ителмәгән һәм ентекле фекер алышыу түбәндә. QA һәм QB хинондарынан тыш, RC-LH114-W структураһында ике хелатлы UQ молекулаһы (RC һәм LH1 йөҙөктәре араһында урынлашҡан) үҙҙәренең яҡшы хәл ителгән баш төркөмдәре буйынса (яуаплы рәүештә Q1 һәм Q2-лә урынлашҡан) бүленә. йыһан). 5С һүрәте). Q1-гә ике изопрен берәмеге бирелә, ә тығыҙлыҡ картаһы Q2-нең тулы 10 изопрен ҡойроғон хәл итә. RC-LH116 структураһында өс хелатлы UQ10 молекулаһы (Q1-ҙән Q3-кә тиклем, 5D һүрәте) хәл ителгән, һәм бөтә молекулалар ҙа ҡойроҡ буйлап асыҡ тығыҙлыҡҡа эйә (5-се һүрәт, D-нан G-ға тиклем). Ике структурала Q1 һәм Q2 хинон баш төркөмдәренең позициялары бик яҡшы эҙмә-эҙлеклелеккә эйә (S12F һүрәте), улар RC менән генә үҙ-ара тәьҫир итә. Q1 RC-LH114-W-ның W ярсығы инеү урынында урынлашҡан (1G һәм 5-се һүрәттәр, C, D һәм E), ә Q2 QB бәйләү урыны янында урынлашҡан (5-се һүрәт, C, D) һәм F). Консервацияланған L-Trp143 һәм L-Trp269 ҡалдыҡтары бик яҡын Q1 һәм Q2 һәм потенциаль π-штабелировать үҙ-ара тәьҫир итешеү тәьмин итә (һүрәт 5, Е һәм F, һәм һүрәт S12). L-Gln88, Q1 дисталь кислородынан 3,0 Å, ныҡлы водород бәйләнешен тәьмин итә (5Е һүрәте); был ҡалдыҡ иң алыҫ бәйләнештән башҡа бөтә РК-ларҙа ла һаҡлана (S13 һүрәте). L-Ser91 консерватив алмаштырыла Thr күпселек башҡа RCs (һүрәт S13), 3.8 ангстром метил кислород Q1, һәм көсһөҙ водород бәйләнештәрен тәьмин итә ала (һүрәт 5Е). Q3 махсус үҙ-ара тәьҫир итешеүгә эйә түгел кеүек, әммә RC-M субблогы һәм LH1-α 5-6 субблогы араһындағы гидрофоб өлкәлә урынлашҡан (5-се һүрәт, D һәм G). Q1, Q2 һәм Q3 йәки яҡындағы хелатлы хинондар ҙа Тч-ла хәл ителгән. Йәмле, Трв. штамм 970 һәм Blc. Ириса структураһы (9, 10, 12) RC-LH1 комплексында консерватив ярҙамсы хинон бәйләү урынына күрһәтә (S12G һүрәте). RC-LH116 биш тарҡалған UQs менән яҡшы килешеп тора 5.8 ± 0.7 һәр комплекс билдәләнгән юғары етештереүсәнлекле шыйыҡса хроматографияһы (ВЭЖХ), шул уҡ ваҡытта өс тарҡалған UQs RC-LH114-W түбәнерәк үлсәү ҡиммәте 6.2 ± 0.3 унда S1 күрһәтә. структура.
Псевдосимметрик L һәм M полипептидтарының һәр береһендә биш ТМН бар һәм улар бер BChl димерын, ике BChl мономерын, ике бактериофаг (BPh) мономерын һәм бер гем булмаған тимерҙе һәм бер йәки ике UQ10 молекулаһын берләштергән гетеродимер барлыҡҡа килтерә. Терминаль кетон төркөмөндә водород бәйләнештәренең булыуы һәм уның Rps-та билдәле тупланыуы аша каротиноидтар М-подблокҡа инә, ул цис-3,4-дегидророродопин тип атала. Төрҙәре (25). RC-H-ның тышҡы мембрана домены мембранаға бер ТМН ярҙамында нығытылған. Дөйөм РК структураһы туғандаш төрҙәрҙең (мәҫәлән, Rba) өс субблок РК-һына оҡшаш. сфероидтар (PDB ID: 3I4D). Макроциклдар BChl һәм BPh, каротиноид нигеҙе һәм гем булмаған тимер был структуралар диапазонында ҡаплана, шулай уҡ UQ10 баш төркөмө QA сайтында һәм QB хинон RC-LH116 (һүрәт S15).
RC структураларының төрлө булыуы менән төрлө QB сайты занятость ставкалары яңы мөмкинлек бирә тикшерергә эҙмә-эҙлекле конформацион үҙгәрештәр оҙатып QB хинон бәйләү. RC-LH116 комплексында QB хиноны тулыһынса бәйләнгән “проксималь” позицияла урынлашҡан (26), әммә RC-LH114-W айырыуында QB хиноны юҡ. RC-LH114-W-ла QB хиноны юҡ, был ғәжәпләндерә, сөнки комплекс әүҙем, структур хәл ителгән QB хиноны менән RC-LH116 комплексына ҡарағанда күберәк. 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып асыҡ RC-LH116 йөҙөгөндә өсәүһе генә структур яҡтан сикләнгән. Был структур боҙолоу RC-LH114-W QB урындарының тиҙерәк алмашыныуын, комплекста хинон кинетикаһының тиҙерәк булыуын һәм LH1 иллюминаторын аша үткән ихтималлыҡтың артыуын сағылдырыуы ихтимал. Беҙ тәҡдим итәбеҙ, тип RC QB сайтында UQ етешмәүе RC-LH114-W ҡатмарлыраҡ һәм әүҙемерәк комплекс һөҙөмтәһе булыуы мөмкин, һәм QB сайтында RC-LH114-W шунда уҡ туңдырылған UQ әйләнеше Конкрет этап (QB сайтына инеү ябылған был конформация ref.
QB-һыҙ, оҙатыусы әйләнеш L-Phe217 позицияһына, был UQ10 бәйләү менән ярашлы түгел, сөнки ул ҡойроҡтоң беренсе изопрен берәмеге менән киңлектә бәрелеш сәбәп буласаҡ (һүрәт 6А). Бынан тыш, асыҡ төп конформацион үҙгәрештәр асыҡ, бигерәк тә спираль де (ҡыҫҡа спираль иллюминатор араһында ТМХ D һәм Е) унда L-Phe217 күсерелгән QB бәйләү кеҫәһе һәм әйләнеш L-Tyr223 (һүрәт 6А ) өҙөү өсөн водород бәйләнеше менән QB binding end4 м- сайты (6-сы һүрәт В). Спираль де шарнирҙары уның нигеҙендә, L-Ser209-дың Cα 0,33Å-ға күсә, ә L-Val221Cα-һы 3,52Å-ға күсә. ТМХ D һәм E-ла күҙәтелгән үҙгәрештәр юҡ, улар ике структурала ла өҫтөнә ҡуйыла (6-сы һүрәт А). Беҙгә билдәле булыуынса, был тәбиғи РК-ла беренсе структура, ул QB сайтын яба. Тулы (QB-бәйле) структура менән сағыштырыу күрһәтеүенсә, хинонды кәметкәнсе, уны хинонға индереү өсөн конформацион үҙгәреш талап ителә. L-Phe217 әйләнеп, хинон баш төркөмө менән π-укладка үҙ-ара тәьҫир итешеүен барлыҡҡа килтерә, ә спираль тышҡа күсә, был L-Gly222 скелеты һәм L-Tyr223 ян сылбырына тотороҡло водород бәйләнеше структураһы менән водород бәйләнеше селтәрен барлыҡҡа килтерергә мөмкинлек бирә (6-сы һүрәт, А һәм С).
(А) Ҡапланған йәнһүрәт голограмма (L сылбыр, әфлисун/M сылбыр, ҡыҙыл) һәм апо (һоро) структураһы, унда төп ҡалдыҡтар рәүешендә күрһәтелә стержень кеүек күрһәтеү. UQ10 һары һыҙыҡ менән күрһәтелгән. Нөктәле һыҙыҡ бөтә структурала барлыҡҡа килгән водород бәйләнештәрен күрһәтә. (В һәм С) өҫкө күрһәтеү аполипопротеин һәм бөтә йөҙөк структураһы, ян сылбыр кислород L-Phe217 күк һәм L-Tyr223 ҡыҙыл төҫтә айырып күрһәтеү, ярашлы рәүештә. L субъединицаһы һорғолт төҫтә; М һәм Н субберәмектәре төҫлө түгел. (D һәм E) Аполипопротеин (D) һәм бөтә (E) RC QB сайттар [төҫө буйынса (А) ярашлы рәүештә] һәм Термофил термофил PSII (йәшел, күк пластик хинон менән; PDB ID: 3WU2) тура килтерергә (58).
Көтөлмәгәнсә, LH1-һеҙ QB-дефицитлы РК-ларының бер нисә структураһы булһа ла, был тикшеренеүҙең күҙәтелгән конформацион үҙгәрештәре тураһында быға тиклем хәбәр ителмәгән. Улар араһында Blc-тан QB структураһы ла бар. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Тч. типидум (PDB ID: 1EYS) (28) һәм Rba. сфероидтар (PDB ID: 1OGV) (29), улар барыһы ла дөйөм QB структураһы менән бер үк тиерлек. 3PRC-ны ентекләп тикшергәндән һуң, LDAO (Лаурил диметил амин оксиды) йыуыу молекулалары QB позицияһына ингән ерҙә бәйләнә, был ябыҡ конформацияға үҙгәртеп ҡороуға ҡамасаулай ала. LDAO 1EYS йәки 1OGV-ла бер үк позицияла тарҡалмаһа ла, был РК-лар бер үк йыуыу сараһы ҡулланып әҙерләнә, шуға күрә бер үк эффект бирергә мөмкин. Рбаның кристаллы төҙөлөшө. Сфаероидтар RC цитохром с2 менән бергә кристалллаштырылған (PDB ID: 1L9B) шулай уҡ ябыҡ QB урыны бар кеүек. Әммә был осраҡта RC-M полипептидының N-терминаль өлкәһе (Q спиральындағы Tyr ҡалдығының H бәйләнеше аша QB бәйләү урыны менән үҙ-ара тәьҫир итешеү) тәбиғи булмаған конформация ҡабул итә, ә QB конформацион үҙгәреше артабан тикшерелмәй (30 ). Нимә тынысландыра, беҙ был төр деформация күргән юҡ М полипептид RC-LH114-W структураһы, был тиерлек шул уҡ N-терминаль районы RC-LH116 RC. Шуны ла билдәләп үтергә кәрәк, йыуыу нигеҙендә LH1 антеннаһын юҡ иткәндән һуң, ПДБ-ла аполипопротеид РК-лары хәл ителде, был РК һәм тирә-яҡтағы LH1 йөҙөгөнөң эске йөҙө араһындағы арауыҡтағы эске хинон пулдарын һәм липидтарҙы бөтөрҙө (31, 32). RC функциональ булып ҡала, сөнки ул бөтә кофакторҙарҙы һаҡлай, тарҡалыусан QB хинондан башҡа, ул әҙерәк тотороҡло һәм йыш ҡына әҙерләү процесында юғала (33). Бынан тыш, билдәле булыуынса, LH1 һәм тәбиғи цикл липидтарҙы RC-нан сығарыу функцияларға йоғонто яһай ала, мәҫәлән, заряд менән айырылған P+QB-хәлдең ҡыҫҡартылған ғүмерен (31, 34, 35). Шуға күрә беҙ фаразлайбыҙ, тип урындағы LH1 йөҙөк тирәләй RC һаҡлап ҡалырға мөмкин “ябыҡ” QB майҙансыҡ, шуның менән һаҡлап урындағы мөхит янында QB.
Аполипопротеин (QB хинонһыҙ) һәм тулы структураһы тик ике генә снимоктарҙы күрһәтһә лә, QB сайты әйләнеше, ә ваҡиғалар теҙмәһе түгел, тип күрһәтмәләр бар, тип бәйләү ҡапҡалы була ала, тип иҫкәртергә ҡабаттан бәйләү гидрохинон Субстрат тормошҡа ашырыуҙы тормошҡа ашырыу өсөн. Аполипопротеиндың QB урыны янында хинолол һәм хинондың үҙ-ара тәьҫир итешеүе төрлөсә булыуы мөмкин, был уны РК тарафынан кире ҡағыуға килтерә. Хинондарҙы бәйләүҙә һәм кәметкәндә конформацион үҙгәрештәрҙең роль уйнауы күптән тәҡдим ителә. Ҡараңғыға яраҡлашҡандан һуң туңдырылған РК-лар хинондарҙы кәметергә һәләтлелеге боҙола (36); Рентген кристаллографияһы күрһәтеүенсә, был зыян QB хинондары әүҙем проксималь позициянан яҡынса 4,5 Å алыҫлыҡта “дисталь” конформацияла тоҙаҡҡа эләгеүе менән бәйле (26) , 37). Беҙ был дисталь бәйләү конформацияһы аполипопротеин һәм тулы йөҙөк структураһы араһындағы арауыҡ хәленең снимокы булып тора, тип тәҡдим итәбеҙ, ул хинон менән тәүге үҙ-ара тәьҫир итешеү һәм QB сайты асылыуынан һуң килә.
Ҡайһы бер фототроф бактериялар һәм цианобактериялар, һыу үләндәре һәм үҫемлектәрҙең ПСИИ комплексында осраған II типтағы РК структур һәм функциональ һаҡланыуға эйә (38). 6-сы һүрәттә күрһәтелгән структур тура килтереүҙе (D һәм E) PSII RCs һәм бактериаль RC комплексының QB урыны араһындағы оҡшашлыҡты һыҙыҡ өҫтөнә ала. Был сағыштырыу күптән инде хинондарҙы бәйләү һәм кәметергә тығыҙ бәйле системаларҙы өйрәнеү өсөн модель булып тора. Алдағы баҫмаларҙа конформацион үҙгәрештәр хинондарҙағы ПСИИ кәметелеүе менән бергә бара тип фаразланған (39, 40). Шуға күрә, РК-ның эволюцион һаҡланыуын иҫәпкә алып, быға тиклем күҙәтелмәгән бәйләү механизмы кислородлы фототроф үҫемлектәрҙә ПСИИ РК-ның QB урынына ла ҡулланыла ала.
Rps ΔpufW (маркировкаланмаған pufW юйыу) һәм PufW-His (С-терминал 10x His-маркировкалы аҡһым-W тәбиғи pufW локусынан экспрессланған) штаммдары. палустрис CGA009 беҙҙең алдағы хеҙмәттә һүрәтләнгән (16). Был штаммдар һәм изоген ҡырағай типтағы ата-әсә туңдырғыстан тергеҙелгән, һыҙыҡлы аҙ һанлы күҙәнәктәр өҫтөндә PYE (һәр 5 г литр -1) (һаҡланған LB -80 °C, составында 50% ( мас./күләм) глицерин) аҡһым, әсетке экстракты һәм сукцинат (% пла.]в) агар/в.5. Ҡараңғыла бүлмә температураһында анаэроб шарттарҙа төнө буйы инкубациялана, ә һуңынан OSRAM 116-W галоген лампочкалары (RS Components, UK) тарафынан тәьмин ителгән аҡ яҡтылыҡ (~50 мкмоль-2 с-1) менән яҡтыртыла, 3-5 көн дауамында бер колония барлыҡҡа килгәнсе. мл М22+ уртаса (41) 0,1% (мас./күләм) казаминокислоталары (артабан М22 тип атала) менән тулыландырылған инокуляция өсөн бер колония ҡулланылған. Культураны ҡараңғыла 34°С температурала 48 сәғәт дауамында 180 әйләнеш/мин тиҙлектә һелкетеп үҫтергәндәр, һуңынан шул уҡ шарттарҙа 24 сәғәт дауамында 70 мл культура инокуляциялағандар. мл күләмендәге ярым аэроб культура ҡулланыла, 30 мл М22 урталыҡты 30 мл универсаль винтовой өҫтө үтә күренмәле быяла шешәгә инокуляциялау һәм 48 сәғәт дауамында стериль магнит көсө менән болғатыу (~50 мкмольм-2 с-1) менән нурландырыла Stirring rod. Һуңынан 30 мл культураны шул уҡ шарттарҙа яҡынса 1 литр культура менән прививкалайҙар, артабан ~200 мкмоль-2 с-1 температураһында яҡтыртылған 9 литр самаһы культураны 72 сәғәт дауамында прививкалау өсөн ҡулланалар. Күҙәнәктәр 7132 RCF температураһында 30 минут центрифугалау юлы менән йыйыла, ~10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8,0)-та ресуспендировать ителә һәм кәрәк булғанға тиклем -20°C температурала һаҡлана.
Иреткәндән һуң, ресуспендированный күҙәнәктәргә бер нисә дезоксирибонуклеаза I (Merck, Бөйөк Британия), лизоцим (Merck, Бөйөк Британия) һәм ике Roche голофермент протеазаһы ингибиторы таблеткаһы (Merck, Бөйөк Британия) кристалдары өҫтәйҙәр. мең функциялы француз баҫым күҙәнәгендә (Aminco, АҠШ) күҙәнәктәр 8-12 тапҡыр боҙола. 18500 RCF температурала 4°C температурала 15 минут центрифугалау юлы менән өҙөлмәгән күҙәнәктәрҙе һәм иремәй торған ҡалдыҡтарҙы сығарғандан һуң, мембрана пигментлы лизаттан 113000 RCF температурала 43000°C температурала 2 сәғәт центрифугалау юлы менән ҡойола. Иретелгән фракцияны ташларға һәм төҫлө мембрананы 100-200 мл 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) эсендә ресуспендировать итергә һәм күренгән агрегаттар булмағансы гомогенлаштырырға. Суспензияланған мембрана 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) (Anatrace, АҠШ) составында 2% (мас./күләм) β-DDM 1 сәғәт ҡараңғыла 4°C температурала йомшаҡ ҡына болғатып инкубациялана. Һуңынан 70°C температурала центрифугала 150 000 RCF 4°C температурала 1 сәғәт дауамында иретергә, ҡалдыҡ иретелмәгән матдәләрҙе сығарырға.
мл DEAE Sepharose ион алмаштырыу колонкаһына өс колонка күләме (CV) бәйләүсе буфер [20 мМ трис-HCl (рН 8,0) составында 0,03% (мас. / объем) β-DDM] ҡулланылған. Колонканы ике CV бәйләүсе буфер менән йыуалар, һуңынан колонканы 50 мМ NaCl булған ике бәйләүсе буфер менән йыуалар. RC-LH116 комплексы 1,75 CV өҫтөндә 150-нән 300 мМ NaCl (бәйләү буферында) һыҙыҡлы градиент менән элюирлана, ә ҡалған бәйләү комплексы 0,5 CV өҫтөндә 300 мМ NaCl булған бәйләү буферы менән элюирлана. 250 һәм 1000 нм араһында абсорбция спектрын йыйыу, абсорбция нисбәте менән фракция (A880/A280) 1-ҙән ҙурыраҡ 880 280 нм, уны ике тапҡыр бәйләүсе буферҙа һыуытып алыу һәм шул уҡ процедураны яңынан ҡулланыу DEAE колонкаһында Таҙартыу тураһында. Һыуытылған фракциялар менән А880/А280 нисбәттәре юғары 1,7 һәм А880/А805 нисбәттәре юғары 3,0, өсөнсө турҙа ион алмашыу башҡарыу, һәм һаҡлап ҡалыу өсөн фракциялар менән А880/А280 нисбәттәре юғары 2,2 һәм А880/А805 нисбәттәре юғары.0. 100,000 молекуляр ауырлыҡтағы өҙөлгән Amicon (MWCO) үҙәктән ҡасыу фильтрында (Мерк, Бөйөк Британия) өлөшләтә таҙартылған комплекс ~2 мл тиклем концентрацияланған һәм Superdex 200 16/600 ҙурлыҡтағы сығарыу колонкаһына тейәлгән (GE Healthcare, АҠШ) буферында 200 м thelume. 1,5 резюме. Йыйыу абсорбция спектрҙары күләме сығарыу фракцияһы, һәм концентрациялау абсорбция спектрҙары менән A880/A280 нисбәттәре өҫтөндә 2.4 һәм A880/A805 нисбәттәре өҫтөндә 5.8 100 A880, һәм шунда уҡ уларҙы ҡулланыу өсөн крио-ТЭМ селтәр әҙерләү йәки һаҡлау кәрәк un°C0.
мл HisPrep FF Ni-NTA Сефароза колонкаһына (20 мМ трис-HCl (рН 8,0) составында 200 мМ NaCl һәм 0,03% (мас./мас.)) IMAC буферында ( GE) ҡулланылған. v) β-ДДМ]. Колонканы биш CV IMAC буферы менән йыуалар, һуңынан биш CV IMAC буферы менән составында 10 мМ гистидин булған. Ядро комплексы колонканан 100 мМ гистидинлы биш IMAC буферы менән элюирлана. RC-LH114-W комплексы составындағы фракция ~10 мл тиклем концентрациялана ~10 мл тиклем 100 000 MWCO фильтр менән йыһазландырылған болғатылған цистернала (Мерк, Бөйөк Британия), 20 тапҡыр бәйләүсе буфер менән һыуытылған, ә һуңынан 25 мл тиклем өҫтәлгән coCVn буферында DEAE b Sephaur ҡулланыла, алдан бирелде. Йыуып колонка дүрт CV бәйләү буферҙары, һуңынан элюировать комплексы һигеҙ CVs һыҙыҡлы градиент 0 100 мМ NaCl (бәйләүсе буферҙа), һәм ҡалған дүрт CVs составында 100 мМ бәйләүсе буфер Ҡалдыҡ комплекстар хлодий менән элюировать натрий8de0. 100,000 MWCO үҙәктән ҡасыу фильтрында Amicon ~2 мл тиклем концентрацияланған һәм 1,5 CV IMAC менән тултырылған алдан Буфер балансланған Superdex 200 16/600 buffere fufferme һәм эксклюзияланған. 1,5 резюме. Йыйыу спектрҙары абсорбция ҙурлыҡ-сығарыу фракциялары һәм концентрациялау абсорбция спектрҙары менән A880/A280 нисбәттәре өҫтөндә 2.1 һәм A880/A805 нисбәттәре өҫтөндә 4.6 100 A880, улар шунда уҡ туңдырылған ТЭМ селтәре әҙерләү өсөн ҡулланыла йәки һаҡлана until -80.
Түбән температуралы ТЭМ селтәрҙәрен әҙерләү өсөн Leica EM GP иммерсион туңдырғысы ҡулланылған. Комплекс IMAC буферында 50-нән торған А880 тиклем һыуытылған, ә һуңынан 5 мкл яңы ялтырап торған QUANTIFOIL 1,2/1,3 углерод менән ҡапланған баҡыр селтәренә (Agar Scientific, Бөйөк Британия) тейәлгән. Селтәрҙе 20°С һәм 60% сағыштырмаса дымлылыҡта 30 с инкубациялайҙар, һуңынан 3 с киптерәләр, ә һуңынан -176°С температурала шыйыҡ этанда һүндерәләр.
RC-LH114-W комплексы мәғлүмәттәре eBIC (Электрон биовизуализация үҙәге) (Британия алмаз яҡтылыҡ сығанағы) Титан Криос микроскобы менән теркәлгән, ул тиҙләтеүсе көсөргәнештә эшләй 300кВ, энергия менән 130,000 Chose of-2× һәм an Мәғлүмәттәр йыйыу өсөн иҫәпләү режимында һүрәттәрҙе яҙып алыу өсөн K2 пик детекторы менән Gatan 968 GIF Quantum ҡулланылған. Калибрланған пиксель ҙурлығы 1,048Å, ә доза тиҙлеге 3,83 е-Å-2s-1 тәшкил итә. секундта фильмды йыйып, 40 өлөшкә бүлгән. Углерод менән ҡапланған урынды ҡулланып, микроскопты яңынан фокуслаштырығыҙ, ә һуңынан бер соҡорға өс фильм йыйығыҙ. Дөйөм алғанда 3130 фильм йыйылған, дефокус ҡиммәттәре -1 һәм -3 мкм араһында.
RC-LH116 комплексы өсөн мәғлүмәттәр шул уҡ микроскоп ярҙамында Астербери биоструктура лабораторияһында (Лидс университеты, Бөйөк Британия) йыйылған. Мәғлүмәттәр 130 к ҙурайтыу менән иҫәпләү режимында йыйылған, ә пиксель ҙурлығы 4,6 е-Å-2s-1 дозаһы менән 1,065 Å тиклем калибрланған. Кино 12 секундта яҙылған һәм 48 өлөшкә бүленгән. Дөйөм алғанда 3359 пленка йыйылған, дефокус ҡиммәттәре -1 һәм -3 мкм араһында.
Бөтә мәғлүмәттәрҙе эшкәртергә Relion 3.0 торба үткәргесендә башҡарыла (42). Ҡулланыу Motioncorr 2 (43) төҙәтеү өсөн нур хәрәкәт доза тартыу, ә һуңынан ҡулланыу CTFFIND 4.1 (44) билдәләү өсөн CTF (контраст тапшырыу функцияһы) параметры. 2-се һүрәттә был тәүге эшкәртелеү этаптарынан һуң типик фотомикрографиялар күрһәтелгән. S16. Автоматик һайлау шаблоны генерациялана ҡул менән һайлау тураһында 250 пиксель 1000 киҫәксәләр 250-пиксель кадрҙа һәм бер ниндәй ҙә һылтанма ике үлсәмле (2D) классификация, шуның менән был классификацияларҙы кире ҡаға, улар өлгө бысраныуына яуап бирә йәки һиҙелерлек үҙенсәлектәре юҡ. Артабан бөтә микрофотографияларҙа ла автоматик һайлау үткәрелгән, ә RC-LH114-W 849 359 киҫәксә, ә RC-LH116 комплексы 476 547 киҫәксә тәшкил иткән. Бөтә һайланған киҫәксәләр ике тур үткән һылтанма булмаған 2D классификация, һәм һәр йүгергәндән һуң, киҫәксәләр, углерод майҙаны ҡаршы ала, өлгө бысраныу, асыҡ үҙенсәлектәре юҡ йәки ныҡ ҡапланған киҫәксәләр кире ҡағыла, һөҙөмтәлә 772,033 (90.9%) һәм 359,678 Parles ҡулланыу өсөн3d . RC-LH114-W һәм RC-LH116 ярашлы рәүештә. Тәүге 3D эҙләнеүҙең моделе стохастик градиент төшөү ысулы менән генерацияланған. Башланғыс модель һылтанма булараҡ ҡулланып, һайланған киҫәксәләр 3D-ла дүрт категорияға бүленгән. Был категориялағы модель һылтанма булараҡ ҡулланып, иң ҙур категориялағы киҫәксәләр өҫтөндә 3D рафинациялау башҡарыу, һуңынан башланғыс 15Å түбән үткәреү фильтр ҡулланыу өсөн иреткес майҙанын ҡаплау, өҫтәү өсөн 6 пиксель йомшаҡ ситтәре, һәм пост-эшкәртергә пикселдәр төҙәтеү өсөн Gatan K2 transfer function өҫкө Mo. RC-LH114-W мәғлүмәттәр йыйылмаһы өсөн был башланғыс модель битлек ситтәрендәге көслө тығыҙлыҡты алып ташлау юлы менән үҙгәртелгән (UCSF Chimera-ла ядро ​​комплексы тығыҙлығынан өҙөлгән). Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән моделдәр (RC-LH114-W һәм RC-LH116 асыҡлыҡтары ярашлы рәүештә 3,91 һәм 4,16 Å) 3D классификацияһының икенсе туры өсөн һылтанма булараҡ ҡулланыла. Ҡулланылған киҫәксәләр башланғыс 3D класҡа төркөмләнгән һәм күршелек менән көслө бәйләнешкә эйә түгел. Ҡапланыу йәки асыҡ структур үҙенсәлектәре булмауы. 3D классификацияһының икенсе турынан һуң, иң юғары асыҡлыҡ менән категория һайланды [RC-LH114-W өсөн, бер категория 377,703 киҫәксәләр (44,5%), RC-LH116 өсөн, бында ғына ике категория бар, дөйөм алғанда 260,752 киҫәксәләр are7me. ҙур булмаған айырма менән тәүге әйләнештән һуң]. Һайланған киҫәксәләр 400 пиксельле йәшниктә яңынан сығарыла һәм 3D рафинациялау юлы менән рафинациялана. Иреткес битлек генерациялана ҡулланыу башланғыс 15Å түбән үткәреү фильтр, 3 пиксель карта киңәйтеү һәм 3 пиксель йомшаҡ битлек. Ҡулланыу өсөн бер киҫәксәгә CTF рафинациялау, бер киҫәксәгә хәрәкәтте төҙәтеү һәм икенсе турҙа бер киҫәксәгә CTF рафинациялау, 3D рафинациялау, иреткес маскировка һәм пост-эшкәрткәндән һуң һәр аҙымдан һуң артабан рафинациялау өсөн һөҙөмтәле текстура башҡарыла. FSC (Фурье ҡабығы корреляцияһы коэффициенты) 0,143 сик ҡиммәтен ҡулланып, RC-LH114-W һәм RC-LH116-ның һуңғы моделдәренең асыҡлыҡтары ярашлы рәүештә 2,65 һәм 2,80Å тәшкил итә. Һуңғы модель FSC ҡойроғо күрһәтелгән һүрәттә 2. S17.
Бөтә аҡһым эҙмә-эҙлеклелеге ЮниПротКБ: LH1-β (ПуфБ; ЮниПрот ID: Q6N9L5) скачать ителә; LH1-α (ПуфА; ЮниПротИД: Q6N9L4); RC-L (ПуфЛ; ЮниПрот ID: O83005); RC-M (ПуфМ; ЮниПрот идентификаторы: А0А4З7); RC-H (Пуха; ЮниПрот ИД: А0А4З9); Аҡһым-W (PufW; ЮниПрот ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) RC-ның гомология моделен төҙөү өсөн ҡулланылған, унда RC-L, RC-M һәм RC-H аҡһымдарының эҙмә-эҙлеклелеге һәм Rba-ның кристалл структураһы бар. сфероидтар RC шаблон булараҡ ҡулланылған (PDB ID: 5LSE) (46). Ҡулланыу “картаһы тура килә” ҡоралы UCSF Химера генерацияланған модель картаһына тура килтерергә (47), аҡһым структураһын яҡшыртыу, һәм кофактор [4×BChl а (мономер китапханаһы ҡалдыҡтары исеме = BCL), 2×BPh а (BPH), бер йәки ике төрлө UQ10 (U10), бер булмаған-гем) 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] ҡулланыу Coot (48) өҫтәү өсөн. QAK мономер китапханаһында булмағанлыҡтан, ул PHENIX-тағы eLBOW инструменты ярҙамында параметрлаштырылған (49).
Артабан LH1 субблогы төҙөлә. Тәүҙә PHENIX-тағы автоматик төҙөлөш ҡоралы (49) картаны һәм LH1-α һәм LH1-β аҡһым эҙмә-эҙлеклелеген индереү сифатында ҡулланып LH1 эҙмә-эҙлеклелегенең бер өлөшөн автоматик рәүештә төҙөү өсөн ҡулланылған. Иң тулы LH1 субъединицаһын һайлап, уны сығарып, Coot-ҡа тейәп, унда юҡ эҙмә-эҙлеклелекте ҡул менән өҫтәп, ике BCls а (BCL) һәм спириллоксантин (CRT) өҫтәгәнсе бөтә структураны рафинациялау [тейешле Rps буйынса LH1 комплексы тығыҙлығы һәм каротиноид составы билдәле. Төрҙәре (17)]. Күсермәһе тулы LH1 субъединица, һәм ҡулланыу UCSF Химера “Док картаһы ҡоралы” док эргәһендәге модель булмаған районда LH1 тығыҙлығы, ә һуңынан уны рафинировать Coot; ҡабатлау процесы тиклем бөтә LH1 субъединицалары моделләштерелгән. RC-LH114-W структураһы өсөн, Coot-та бүленмәгән тығыҙлыҡты сығарыу юлы менән, аҡһым USCF Химера картаһында ҡалған аҡһым булмаған компоненттарҙан сегментлана һәм башланғыс модель булдырыу өсөн Autobuild инструменты ҡулланыла, ә ҡалған субъединицалар (аҡһым-W) Моделләштереү. ФЕНИКС-та (49). Һөҙөмтәлә барлыҡҡа килгән модельгә Coot (48)-тә ниндәй ҙә булһа юҡ эҙмә-эҙлеклелектәрҙе өҫтәгеҙ, ә һуңынан бөтә субъединицаны ҡул менән рафинациялағыҙ. Ҡалған бүленмәгән тығыҙлыҡ липидтар комбинацияһына тура килә (PDB мономер китапханаһы ID CDL = CDL, POPC = 6PL һәм POPG = PGT), β-DDM йыуыу ҡоралы (LMT) һәм UQ10 молекулалары (U10). Ҡулланыу PHENIX оптимизация (49) һәм ҡул оптимизация Coot (48) камиллаштырыу өсөн тулы башланғыс моделе тиклем модель статистикаһы һәм визуаль сифаты тура килә артабан яҡшыртыу мөмкин түгел. Ниһайәт, LocScale (50) ҡулланып, урындағы картаны үткерләү, ә һуңынан бүленмәгән тығыҙлыҡты һәм автоматик һәм ҡул менән оптимизациялауҙы моделләштереүҙең тағы бер нисә циклын башҡарыу.
һәм 2-се һүрәттәрҙә тейешле пептидтар, кофакторҙар һәм башҡа липидтар һәм хинондар үҙҙәренең тығыҙлығы сиктәрендә йәбештерелгән. Һуңғы модель статистик мәғлүмәттәре S1 таблицаһында күрһәтелгән.
Әгәр башҡаса күрһәтелмәһә, УФ/Vis/NIR абсорбция спектрҙары Cary60 спектрофотометрында (Agilent, АҠШ) 250 нм-ҙан 1000 нм-ға тиклем 1 нм арауыҡта һәм интеграция ваҡыты 0,1с йыйылған.
Өлгө кварц кюветала 2 мм юл менән 1-ҙән А880 тиклем һыуытылған, һәм 400 һәм 1000 нм араһындағы абсорбция спектрын йыйыу. Түңәрәк дихроик спектрҙар Jasco 810 спектроляриметрында (Jasco, Япония) 400 нм һәм 950 нм араһындағы 1 нм арауыҡта 20 нм мин-1 сканерлау тиҙлеге менән йыйылған.
Моляр экстинкция коэффициенты билдәләнә, ядро ​​комплексы һыуытылған A880 яҡынса 50. 10мкл күләмен 990мкл бәйләүсе буфер йәки метанол һыуытылған, һәм абсорбция спектрын йыйыу өсөн шунда уҡ BChl деградацияһын минималь кимәлгә еткерергә. Һәр метанол өлгөһөндәге BChl миҡдары 54,8 мМ-1 см-1-ҙең 771 нм-ҙа һүнеү коэффициенты буйынса иҫәпләнгән, һүнеү коэффициенты билдәләнгән (51). Үлсәү BChl концентрацияһын 32 (RC-LH114-W) йәки 36 (RC-LH116) бүлеп, ядро ​​комплексы концентрацияһын билдәләү өсөн, ул артабан буферҙа йыйылған шул уҡ өлгөнөң абсорбция спектрын билдәләү өсөн ҡулланыла Экстинкция коэффициенты. параллель. Һәр өлгө өсөн өс тапҡыр ҡабатланған үлсәүҙәр алынған, иҫәпләү өсөн BChl Qy максимумының уртаса һеңдерелеүе ҡулланылған. 878 нм-ҙа үлсәнгән RC-LH114-W-ның һүнеү коэффициенты 3280±140 мМ-1 см-1 тәшкил итә, ә 880 нм-ҙа үлсәнгән RC-LH116-ның һүнеү коэффициенты 3800±30 мМ-1 см-1 тәшкил итә.
UQ10 ысулы буйынса һанлаштырылған (52). Ҡыҫҡаһы, кире фазалы ВЭЖХ (RP-ВЭЖХ) Agilent 1200 ВЭЖХ системаһы ярҙамында башҡарылған. 0,02 нмоль тирәһе RC-LH116 йәки RC-LH114-W 50мкл 50:50 метанол:хлороформ составында 0,02% (мас./күләм) хлорид тимер, һәм инъекция алдан тигеҙләнгән Бекман Култер Ультрасфера мм1 мм-4 мм1. 40°С температурала ВЭЖХ иреткесендә (80:20 метанол:2-пропанол) ×25 см колонкала һалына. сәғәт дауамында 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидтар) һәм 780 нм (BChl) абсорбцияһын күҙәтеү өсөн ВЭЖХ иреткесендә изократик элюция башҡарыла. 275 нм хроматограммала 25,5 минутта пик интеграцияланған, унда башҡа асыҡлана торған берләшмәләр булмаған. Интеграцияланған майҙан ҡулланыла иҫәпләү өсөн моляр күләмдә UQ10 сығарылған һылтанма менән калибровка ҡойроғо иҫәпләнгән инъекция таҙа стандарттар 0 5,8 нмоль (һүрәт S14). Һәр өлгө өс тапҡыр анализланды, һәм хәбәр ителгән хата уртаса SD тура килә.
мкМ кәметелгән ат йөрәге цитохромы c2 (Merck, Бөйөк Британия) һәм 0-дан 50 мкMUQ2 (Merck, Бөйөк Британия) менән RC-LH1 комплексы булған иретмә әҙерләнгән, унда максималь Qy һеңдерелеүе 0,1 тәшкил ителә. мл өс өлгө һәр UQ2 концентрацияһында әҙерләнгән һәм үлсәү алдынан ҡараңғыға тулыһынса яраҡлашыуҙы тәьмин итеү өсөн 4°C температурала ҡараңғыла төнө буйы инкубацияланған. Иретмә 300 нм ялҡын/500 һыҙыҡ решеткаһы, 1,24 мм инеү, 0,12 мм урта һәм 0,6 мм сығыу ярсыҡтары менән йыһазландырылған OLIS RSM1000 модулле спектрофотометрға тейәлгән. 600 нм оҙонлоҡтағы үткәреү фильтры өлгө фототрубкаһы һәм эҙмә-эҙлекле фотомножитель трубкаһы инеү урынына ҡуйыла, был ҡуҙғытыу яҡтылығын сығара. Һеңдерелеү 550 нм-ҙа интеграция ваҡыты 0,15 с менән күҙәтелә. Ҡуҙғытыу яҡтылығы 880 нм M880F2 светодиодтан (яҡтылыҡ диоды) (Thorlabs Ltd., Бөйөк Британия) 90% интенсивлыҡтағы оптик-сүс кабеле аша DC2200 контроллеры аша (Thorlabs Ltd., Бөйөк Британия) сығарыла һәм яҡтылыҡ сығанағына 9°0 мөйөшөндә сығарыла. Үлсәү нуры көҙгөгә ҡаршы ҡуйылған, өлгө тәүҙә үҙләштермәгән ниндәй ҙә булһа яҡтылыҡты ҡайтарыу өсөн. с яҡтыртыу алдынан 10 с абсорбцияны күҙәтеү. Һуңынан абсорбция артабан 60 с ҡараңғыла күҙәтелә, хинололдың үҙ-үҙенән цитохром c23 + ни тиклем кәмеүен баһалау өсөн (сеймал мәғлүмәттәр өсөн S8 һүрәтен ҡарағыҙ).
Мәғлүмәттәр 0,5-тән 10 с эсендә һыҙыҡлы башланғыс тиҙлекте тура килтереп эшкәртелгән (UQ2 концентрацияһына ҡарап) һәм һәр UQ2 концентрацияһында өс өлгөнөң дә тиҙлектәрен уртаса алыу. RC-LH1 концентрацияһы тейешле һүнеү коэффициенты буйынса иҫәпләнгән тиҙлекте каталитик һөҙөмтәлелеккә үҙгәртеү өсөн ҡулланылған, Origin Pro 2019 (OriginLab, АҠШ) графикында төшөрөлгән һәм күренгән Км һәм Ккат ҡиммәттәрен билдәләү өсөн Михаэлис-Ментен моделенә ярашлы.
Ваҡытлыса абсорбция үлсәүҙәре өсөн RC-LH1 өлгөһө 50 мМ натрий аскорбаты (Merck, АҠШ) һәм 0,4 мМ Тербутин (Merck, АҠШ) булған IMAC буферында ~2мкМ тиклем һыуытылған. Аскорбин кислотаһы ҡорбан электрон доноры булараҡ ҡулланыла, ә трет-бутаклофен QB ингибиторы булараҡ ҡулланыла, был төп RC доноры үлсәү процесы барышында кәметелгән (йәғни фотоокисланмаған) булып ҡала. Яҡынса 3 мл өлгө өҫтәй ҡулланыусылар әйләнеш күҙәнәк (яҡынса 0,1 м диаметры, 350 об/мин) менән 2 мм оптик юл оҙонлоғо, лазер юлында өлгө етерлек ваҡыт ҡараңғы яраҡлашыу өсөн ҡуҙғытыу импульстары араһында тәьмин итеү өсөн. ~100-fs лазер импульстарын ҡулланыу өсөн көсәйтергә Ti: Сапфир лазер системаһы (Spectra Physics, АҠШ) өлгөһөн 880 нм ҡабатлау тиҙлеге менән 1 кГц (20 нДж өсөн NIR йәки 100 нДж өсөн Vis) ҡуҙғытыу өсөн. Мәғлүмәттәр йыйыр алдынан өлгөнө 30 минут самаһы ҡуҙғытыу яҡтылығына дусар итегеҙ. Экспозиция сәбәп буласаҡ QA инактивация (мөмкин кәметергә QA бер-ике тапҡыр). Әммә иғтибар итегеҙ, был процесс кире ҡайтарыла, сөнки оҙайлы ҡараңғы яраҡлашыу осоронан һуң, RC яйлап ҡайтып QA эшмәкәрлеге. -10-дан 7000 пс-ҡа тиклем тотҡарлыҡ ваҡыты менән күсмә спектрҙарҙы үлсәү өсөн Гелиос спектрометры (Ultrafast Systems, АҠШ) ҡулланылған. Ҡулланыу өсөн ер өҫтө Xplorer программа тәьминәте (Ultrafast Systems, АҠШ) мәғлүмәттәр йыйылмаһын төркөмләү, һуңынан берләштереү һәм стандартлаштырыу. Ҡулланыу CarpetView программа пакеты (Яҡтылыҡ үҙгәртеп ҡороу Ltd., Литва) ҡулланыу өсөн берләштерелгән мәғлүмәттәр йыйылмаһы дифференциаль спектрҙар алыу өсөн тарҡалыу менән бәйле, йәки функция ҡулланыу, тип convolves бер нисә экспонент менән прибор яуап тура килә бер тулҡынлы спектраль эволюцияһы Origin, USALa (Origin).
Үрҙә әйтелгәнсә (53), RC һәм периферик LH2 антеннаһы ла булмаған LH1 комплексы булған фотосинтез пленкаһы әҙерләнгән. Мембрана 20 мМ трис (рН 8,0) менән һыуытылған, һуңынан 2 мм оптик юллы кварц кюветаға тейәлгән. нДж лазер импульсы ҡулланылған өлгөнө 540 нм-ҙа -10-дан 7000 пс-ҡа тиклем тотҡарлау ваҡыты менән ҡуҙғытыу өсөн. Мәғлүмәттәр йыйылмаһын эшкәртергә, нисек тасуирланған өсөн Rps. пал өлгөһө.
Мембрана 150 000 РКФ-та 4°С-та 2 сәғәт центрифугалау юлы менән гранулалана, һуңынан уның 880 нм-ҙа абсорбцияһы 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) һәм 200 мМ NaCl-да ресуспендировать ителә. Мембрана 2% (мас./күләм) β-ДДМ-да 4°С температурала 1 сәғәт ҡараңғыла яйлап болғатып иретергә. Өлгө 100 мМ триэтиламмоний карбонатында (рН 8,0) (TEAB; Merck, Бөйөк Британия) 2,5 мг мл-1 аҡһым концентрацияһына тиклем һыуытылған (Bio-Rad анализы). Артабан эшкәртергә үткәрелгән ысулдан элек баҫылған (54), 50 мкг аҡһым һыуытылғандан башлап, дөйөм 50 мкл TEAB составында 1% (мас./күләм) натрий лаурат (Merck, Бөйөк Британия). с ультразвуктан һуң, ул 5 мМ трис менән кәметелгән(2-карбоксиэтил)фосфин (Мерк, Бөйөк Британия) 37°C 30 минут. S-алкилләү өсөн өлгөнө 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, UK) менән инкубациялайҙар һәм бүлмә температураһында 10 минут 200 мМ изопропанол запас иретмәһенән өҫтәйҙәр. Протеолит аш һеңдереүҙе 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C ҡатнашмаһы (Promega UK) өҫтәп башҡарғандар һәм 37°С температурала 3 сәғәт инкубациялағандар. мкл этилацетат һәм 10 мкл 10% (күләм/күләм) LC сортлы трифторуксус кислотаһы (ТФА; Thermo Fisher Scientific, Бөйөк Британия) өҫтәп, 60 с дауамында вихревой экстракцияланған. Фаза айырыу 15,700 RCF 5 минут центрифугалау ярҙамында булышлыҡ ителә. Етештереүҙең протоколы буйынса, пептидты үҙ эсенә алған түбәнге фазаны һаҡ ҡына аспирациялау һәм тоҙһоҙландырыу өсөн С18 спин-колонкаһы (Thermo Fisher Scientific, Бөйөк Британия) ҡулланылған. Вакуум центрифугалау юлы менән киптергәндән һуң, өлгө 0,5% ТФА һәм 3% ацетонитрилда эретелгән, ә 500 нг наноағымлы РП хроматографияһы ярҙамында масс-спектрометрия менән бергә анализланған, система параметрҙарын ҡулланып, алдан ентекләп яҙылған.
Ҡулланыу MaxQuant v.1.5.3.30 (56) аҡһымды асыҡлау һәм миҡдар эҙләү өсөн Rps. палустрис протеомдары базаһы (www.унипрот.орг/протеомдар/UP000001426). 1990 йылдарҙа был йүнәлештәге эшмәкәрлекте үҫтереүҙең төп маҡсаты булып PRIDE партнер һаҡлағысы аша ProteomeXchange альянсында һаҡланған.
RPLC ярҙамында анализлау өсөн электроспрей ионлаштырыу масс-спектрометрияһы менән бергә ҡырағай типтағы Rps-тан RC-LH1 комплексы әҙерләнгән. Алдан баҫылған ысулды ҡулланып (16), аҡһым концентрацияһы етештерелгән palustris күҙәнәктәрендә 2 мг мл-1 20 мМ Hepes (рН 7,8), 100 мМ NaCl һәм 0,03% (мас./күләм) β- (Bio-Rad анализы) ) DDM. Етештереүҙең протоколы буйынса, 2D таҙартыу комплекты ҡулланып (GE Healthcare, АҠШ) 10 мкг аҡһымды яуым-төшөм ысулы менән сығарыу, һәм яуым-төшөмдө 20 мкл 60% (күләм/күләм) ҡырмыҫҡа кислотаһы (ФА), 20% (күләм/күләм) Ацетонитрил һәм 20%вватерҙа иретергә. Биш микролитр масс-спектрометрия (Maxis UHR-TOF, Брукер) менән бергә РПЛК (Dionex RSLC) ысулы менән анализланған. Ҡулланыу MabPac 1.2×100 мм колонка (Термо Фишер ғилми, Бөйөк Британия) айырыу өсөн 60°C һәм 100мклмин -1, градиент менән 85% (к/к) иреткес А [0.1% (к/к) FA һәм 0.02% (к/к) иреткес B5/v) to85 [0.1%(v/v) FA һәм 0.02%(v/v) 90%(v/v) ацетонитрил ТФА] стандарт электроспрей ионизация сығанағы һәм параметрҙарын ҡулланып, 60 минуттан ашыу, масс-спектрометр 100 2750 м/з (масса-заряд нисбәте) ала. ExPASy биоинформатика ресурс порталы FindPept инструменты (https://web.expasy.org/findpept/) ярҙамында масса спектрын комплекстың субберәмектәренә картаға төшөрөү.
Күҙәнәктәрҙе 72 сәғәт дауамында 100 мл НФ-түбән (10 мкМм-2 с-1), уртаса (30 мкМм-2 с-1) йәки юғары (300 мкМм-2 с-1) яҡтылыҡ аҫтында үҫтерәләр. М22 уртаса (М22 уртаса, унда аммиак сульфаты төшөрөп ҡалдырылған һәм натрий сукцинаты натрий ацетаты менән алмаштырылған) 100 мл винтовкалы шешәлә (23). Биш 30-с циклында 0,1 микронлы быяла монстрҙары 1:1 күләм нисбәтендә күҙәнәктәрҙе лизислау өсөн монстрҙар менән ҡапланған һәм 5 минут боҙ өҫтөндә һыуытылған. Иремәй торған матдә, өҙөлмәгән күҙәнәктәр һәм быяла монстрҙары 16 мең РКФ-та 10 минут дауамында өҫтәл микроцентрифугаһында центрифугалау юлы менән сығарыла. мембрана 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) 40/15% (мас./мас.) сахароза градиентында 100 000 RCF менән Ti 70.1 роторында 10 сәғәт дауамында айырылған.
Беҙҙең алдағы эштә һүрәтләнгәнсә, иммунодетекция Уның билдәһе PufW (16). Ҡыҫҡаһы, таҙартылған ядро ​​комплексы (11,8 нМ) йәки мембрана составында бер үк концентрацияла RC (окисланыу аша билдәләнә кәметелгән айырма спектрын алыу һәм тап килгән йөкләмә буялған гель) 2x SDS тейәү буферында (Merck, Бөйөк Британия) ике тапҡыр һыуытылған. Аҡһымдар 12 процентлы бис-трис NuPage геле (Thermo Fisher Scientific, Бөйөк Британия) репликаһында айырылған. RC-L субъединицаһын тейәү һәм визуализациялау өсөн гель Coomassie Бриллиант Блю (Bio-Rad, Бөйөк Британия) менән буялған. Икенсе гелдәге аҡһым иммуноанализ өсөн метанол менән активлаштырылған поливинилиденфторид (ПВДФ) мембранаһына (Thermo Fisher Scientific, Бөйөк Британия) күсерелгән. ПВДФ мембранаһы 50 мМ трис-НСl (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (күләм/күләм) Твин-20 һәм 5% (күләм/күләм) майһыҙланған һөт порошогында блокланған, ә һуңынан анти-Уның беренсел антитән менән инкубацияланған (буферҙа мН0p 7,6), 150 мМ NaCl һәм 0,05% (күләм/күләм) Твин-20] 1:1000 А190-114А, Бетил лабораториялары, АҠШ) 4 сәғәт. тапҡыр йыуғандан һуң 5 минут антитело буферы, мембрана менән берләштерелгән хрен пероксидаза (Сигма-Ольдрих, Бөйөк Британия) анти-сысҡан икенсел антитело (разбавленный 1:10,000 антитело буферы суб) W инкубировать рөхсәт итеү өсөн асыҡлау (5 минуттан һуң 3 йыуыу u luscesing антитело буферы CESTA0) (Цианаген, Италия) һәм Амершам Имиджер 600 (GE Healthcare, Бөйөк Британия) етештереүселәр.
Һүрәтләү аша интенсивлыҡ бүленә һәр буялған гель йәки иммуноанализ һыҙат, интеграциялау майҙаны аҫтында пик һәм иҫәпләү интенсивлығы нисбәте RC-L (буялған гель) һәм аҡһым-W (иммуноанализ), ImageJ (57) һүрәтте эшкәртергә. Был нисбәттәрҙе моляр нисбәттәргә үҙгәртеп, таҙа RC-LH114-W өлгөһөндә RC-L-дың аҡһым-W-ға нисбәте 1:1 тип фаразлай һәм бөтә мәғлүмәттәр йыйылмаһын шуға ярашлы нормалаштыра.
Был мәҡәлә өсөн өҫтәмә материалдарҙы ҡарағыҙ:
Был Creative Commons атрибуция лицензияһы шарттары буйынса таратылған асыҡ рөхсәт мәҡәләһе. Мәҡәләлә, төп әҫәрҙең дөрөҫ килтерелеүе шарты менән, теләһә ниндәй матбуғатта сикләнмәгән ҡулланыу, таратыу һәм ҡабатлау мөмкинлеге бар.
Иҫкәрмә: Беҙ һеҙҙең электрон почта адресығыҙҙы бирергә генә һорайбыҙ, һеҙ биткә кәңәш иткән кеше белә, һеҙ уларҙы күрергә теләйем, электрон почта һәм был спам түгел. Беҙ бер ниндәй ҙә электрон почта адрестарын тотмаясаҡбыҙ.
Был һорау һеҙҙең ҡунаҡ булыуын тикшерергә һәм автоматик спам тапшырыуҙы булдырмау өсөн ҡулланыла.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвицки, Элизабет С. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А.
Реакция үҙәгендәге яҡтылыҡ тоҙағы 1 комплексының юғары асыҡлыҡтағы структураһы хинон динамикаһы буйынса яңы төшөнсәләр бирә.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Нидзвицки, Элизабет С. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А.
Реакция үҙәгендәге яҡтылыҡ тоҙағы 1 комплексының юғары асыҡлыҡтағы структураһы хинон динамикаһы буйынса яңы төшөнсәләр бирә.
©2021 Фәнде үҫтереүҙең Америка ассоциацияһы. бөтә хоҡуҡтары һаҡлана. АААС — ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф һәм КАУНТЕР компанияларының партнеры. 2375-2548 ISSN.